Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Hayvanlarla tüm yordamları etik önceden onaylanması gerekir. Kuruluşumuz, tüm yordamlar iç hayvan refahı ve etik İnceleme Kurulu (AWERB) onaylandıktan sonra İçişleri Bakanlığı kuruluş, kişisel ve proje lisansları, İngiltere’de hayvan (bilimsel yordamlar) Yasası 1986 uygun olarak gerçekleştirilir. 1. chCD40L hazırlanması Stabil bir çözünür chCD40L hızlı kültür HEK 293-msCD8-CD40L hücreleri inşa 1 x ile ısı inaktive takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) Orta (Merhaba) fetal buzağı serum (FCS) ve % 5 içeren bir ortamda 37 ° C’de 1 µg/mL puromisindir CO 2.Not: Bu hücreler Pirbright uygun malzeme transfer anlaşması imzalanması sonrasında Enstitüsü’nden kullanılabilir. Konfluent ne zaman 1:5 yoğunluğu, hücreleri bölün. Toplamak (çözünür chCD40L yapı içeren) süpernatant her seferinde hücreleri bölme, 400 x g hücresel enkaz kaldırma ve 4 ° C’de depolamak 5 min için de santrifüj kapasitesi Toplanan 500 mL süpernatant sıvı havuz ve filtre sterilize-bu 0.2 µm filtreden. 10 k üretici yönergelerine göre bir molekül ağırlıklı kesim ile santrifüj protein yoğunlaştırıcıları kullanarak süpernatant konsantre. Konsantre süpernatant her sütundan ayıklamak, birlikte havuz ve filtre-bu bir 0,22 µm şırınga filtreden geçirilerek sterilize. Seri olarak 1 chCD40L çözümünde sulandrarak deneylerde kullanılacak son konsantrasyonu belirlemek x Iscove’nın modifiye Dulbecco’nın orta (IMDM) (açıklandığı adım 2,4) ve dilutions huzurunda kodlamayla birincil bursal hücreleri. Bir haftaya kadar her gün için hücrelerin sayısı ve yüzdesi canlılığı belirlemek.Not: hücre çoğalması ve canlılığı yeterli nerede en düşük konsantrasyon assay olarak kullanmak için bölgedir. Bu 1:20 ile 1:50 arasında olması muhtemeldir. 2. tavuk birincil Bursal hücre izolasyon için çözümler hazırlanması 1 Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBBS) x 90 mL steril H2O ve 0,47 Ca ile 10 x HBBS 10 mL ekleyerek kalsiyum (Ca) ile hazırlamak µL % 7.5 NaHCO3. Collagenase D hisse senedi eriyik 8 mg/mL Ca. filtre sterilize etmek ile 1 x HBBS içinde vasıl belgili tanımlık eriyik 0.2 µM filtreden hazırlayın.Not: 5 mL aliquots hazırlamak ve bunları-20 ° C’de dondurmak için tavsiye edilir 1 hazırlamak x RPMI orta takıma % 5 ile Merhaba FCS. Medya 4 ° C’de depolayın Hazırlamak IMDM 1 x 500 mL takıma %8 ile Merhaba FCS, % 2 Merhaba tavuk serum, 50 mM β-mercaptoethanol, insülin transferrin Sodyum selenit ve % 1 penisilin/streptomisin 50 µL. Medya 4 ° C’de depolayınNot: yukarıda belirtilen çözümleri önceden hazırlayın. 1 x HBBS Ca. Store ile çözüm buz üzerinde hazırlamak. 1 x HBBS olmadan Ca Ca olmadan 10 x HBBS 10 mL steril H2O, 0,47 µL % 7.5 NaHCO3ve EDTA adlı 10 mM son bir konsantrasyon 90 mL ekleyerek hazırlayın. Çözüm buz üstünde depolar. 1 x collagenase D çözüm HBBS 18 mL toplamda yapmak Ca ile 13 mL 5 mL collagenase D stok çözeltisi eklenerek hazırlayın. Çözüm buz üstünde depolar.Not: belirtilen adımları 2.5-2.7 denemenin gün çözümleri hazırlayın. 3. Bursa of Fabricius (BF) kaldırılması Kapak ve arka tavuk uygun, onaylanmış bir tesis ve insancıl onları itlaf 2-3 hafta-in yaş.Not: yüzey kaldırma için Enstitüsü onaylı yöntemleri kullanın. BF aseptik teknikler kullanarak her tavuktan toplamak.Not: kurum yerde iletişim kurallarını kullanın. Karkas dorsal recumbency yerleştirin ve deri ve tüyler suda seyreltilmiş % 70 etanol çözeltisi ile karın ve göğüs overlaying sterilize. Ventral ensizyon alt karın bir steril neşter veya makas kullanılarak olun. İki nokta üst üste, lağım için kafatası kaudal bölümüne bağlı bursa of Fabricius bulun. Steril forseps ve bursa of Fabricius kolon ücretsiz kesme Makası kullanarak. Gut delinme önlemek için dikkat ediniz. Org soğuk PBS yerleştirin ve buza laboratuvara aktar.Not: Primer hücre en kısa zamanda organ hasat sonrası yalıtılması gerekir. 4. yalıtım tavuk birincil Bursal hücre Mikrobiyolojik güvenlik kabini, çalışma yıkama BF en az 3 x 30 ml soğuk PBS. Petri kabına (92 mm çapında, 21 mm içinde yükseklik) doku aktarmak ve 5 mL 1 x collagenase D çözeltisi ekleyin. Steril makas ya da daha az 5 mm çapında parçalarını BF oyulmuş bir neşter bıçak kullanıyor. 30 dk için periyodik nazik ajitasyon ile 37 ° C’de doku kuluçkaya.Not: Collagenase çözüm doku sindirmeye başlayacak. Steril bir Pasteur pipet kullanarak, art arda dokuya dağılması teşvik karışımı Aspire edin. Gerekirse, doku daha küçük parçalar halinde kesin. Başka bir 5 mL 1 x collagenase D çözeltisi için doku ekleyin ve başka bir 30 dk için periyodik nazik ajitasyon ile 37 ° C’de kuluçkaya. Doku tamamen sindirilmiş 4,6 ve 4,7 tamamlayana dek.Not: Daha fazla geçiyoruz değil küçük tanecikler olacak. Hücre süspansiyon 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla Ca olmadan 1 x HBBS 20 mL içine geçmek. 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve Pelet 10 mL 1 resuspend x RPMI % 5 FCS ile. 10 mL 5 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate içeren yoğunluk gradient medya de üstüne hücre süspansiyon yerleşimi veya yoğunluk gradient medya 10 mL hücre süspansiyon altında 5 mL altına koymak. İkisi arasında bir açık arayüz olduğundan emin olun. Yerleşimi, 900 x g 4 ° C’de 20 dk için santrifüj kapasitesi Alt veya santrifüj sonunu kaldırmak.Not: Hücreleri bir grup hücre medya ve yoğunluk gradient medya arayüzü oluşturmalıdır. Steril bir Pasteur pipet kullanarak, hücre kaldırma ve soğuk PBS koyun. 3 hücreleri yıkama x 400 x g 5 min için de centrifuging ve onları soğuk PBS resuspending. 5. kültür tavuk birincil Bursal hücre 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve onları tam IMDM x 1 resuspend. Bir aliquot hücre süspansiyon al, Trypan mavi ekleyin ve mavi Trypan dışı hücrelerin sayısını saymak. Hücreleri ve yüzde canlılığı sayısını belirler. 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve bir 1:20 ile desteklenmiş tam IMDM içinde resuspend tavuk CD40L 1 x 107 hücre/mL yoğunluğu, seyreltme. 1:10 ile 1:50 aralığında yalan muhtemelen en iyi seyreltme belirlemek için chCD40L içeren konsantre süpernatant titre. 48-72 h. U popolu 96-şey plakaları düz oturaklı tabakaları bana tercih edilir için ya 96 – veya 24-da tabak 37 ° C’de hücreler kültür.Not: Hücreleri de 40 ° C’de kültürlü 6. IBDV tavuk birincil Bursal hücrelerle enfeksiyonun 48-72 h sonrası yalıtım, bir aliquot girdap örneği, virüsün çözülme ve buza saklayın. Birincil bursal hücreleri resuspend, 10 µL hücre süspansiyon aliquot al, bir Trypan mavi çözüm 10 µL için eklemek ve hücreleri ve yüzde canlılığı sayısını belirler. Virüs enfeksiyonu (virüs inoculum ve girdap yapmak için MOI) uygun çokluğu için tam IMDM x 1 oranında seyreltin. 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve virüs inoculum hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon için periyodik ajitasyon ile 1 h 37 ° C’de kuluçkaya. 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, virüs inoculum kaldırmak ve 1 x komple IMDM medya hücrelerde yıkayın. 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve tam IMDM medya ile tavuk CD40L mL başına 1 x 107 hücre yoğunluğu, takıma hücrelerde resuspend. Ya 96 – veya 24-da tabak 37 ° C’de hücreler kültürNot: Hücreleri de 40 ° C’de kültürlü 7. IBDV çoğaltma tavuk birincil Bursal hücrelerdeki miktar İstediğiniz zaman noktası postinfection, hücreleri resuspend, onlara uygun bir tüp aktarmak, onları vasıl 400 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve plak tahlil veya TCID50 tahlil Reed Muench göre süpernatant virüs titrasyon için hasat yöntemi15. PBS 1 mL hücrelerde yıkama ve immunostaining ile IBDV için belirli bir antikor için onları hazırlamak veya RNA (üreticinin yönergeleri izleyerek) uygun bir seti kullanarak ayıklamak ve Ters transkripsiyon nicel polimeraz zincir gerçekleştirmek reaksiyon (RT-qPCR) kullanarak astar belirli bir IBDV gen (ileri, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Tersine, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Sahte enfekte hücre kültürlerinde bir denetim olarak kullanılmalıdır.