伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

動物とすべての手順は、倫理的事前に承認する必要があります。当院ですべてのプロシージャはホーム オフィス設立、個人とプロジェクトのライセンスの下で英国の動物 (科学的なプロシージャ) 法 1986 に従って内部の動物の福祉と倫理レビュー ボード (AWERB) の承認後実行されます。 1. chCD40L の作製 水溶性 chCD40L を安定して表現文化 HEK 293-msCD8-CD40L 細胞構築のためロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培 10% 熱不活化 (hi) x 1 の牛胎児血清 (FCS) 5% を含む大気中で 37 ° C で 1 μ G/ml ピューロマイシン CO2。注: これらの細胞は、適切な材料移転契約の署名、次パーブライト研究所から入手可能。 1:5 の密度と合流でセルを分割します。収集 (水溶性 chCD40L 構成要素を含む) 上清たびにセルを分割、細胞の残骸を削除し、4 ° C で保存に 5 分間、400 × gで遠心分離 上澄みの 500 mL を収集すると、液体をプール、フィルター – それを殺菌 0.2 μ m フィルターを通過。 製造元の指示に従って 10 K の分子量カットオフと遠心タンパク質コンセントレーターを使用して上清を集中します。各列から集中して上澄みを抽出、それを一緒に、プールおよびフィルター – それを殺菌 0.22 μ m シリンジ フィルターを通してそれを渡すことによって。 直列 1 chCD40L 溶液を希釈することにより、実験に使用する最終的な濃度を決定する x Iscove のダルベッコ希釈の存在下で培養一次ファブリキウス嚢細胞培地 (IMDM) (2.4 で説明されているステップ) の変更します。毎日の週までのセルの数と割合の生存率を決定します。注: 細胞増殖と生存率が十分な低濃度測定で使用する濃度であります。これは 1:20 ~ 1:50 である可能性が高いです。 2. 鶏主のファブリキウス嚢細胞分離用溶液の調製 Ca で 10 x HBBS の 10 mL を滅菌 H2O 0.47 90 mL に追加することによってカルシウム (Ca) とハンクス平衡塩溶液 (HBBS) × 1 を準備 7.5% NaHCO3μ L。 0.2 μ M のフィルターを通してコラゲナーゼ D 原液 8 Mg/ml と ca フィルター滅菌と 1 x HBBS でソリューションを準備します。注: それは 5 ml を準備し、-20 ° C でそれらを凍結することをお勧め 1 を準備 x RPMI 培地を添加した 5% こんにちは FCS。4 ° C でメディアを保管します。 準備 IMDM の 1 x 500 mL を添加した 8% こんにちは FCS、2% こんにちは鶏血清、50 mM β-メルカプトエタノール、インシュリン ・ トランスフェリン–亜セレン酸ナトリウム、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを 50 μ l 添加します。4 ° C でメディアを保管します。注: 上記のすべてのソリューションを事前に準備します。 Ca ストアに 1 x HBBS 氷のソリューションを準備します。 Ca なし 10 x HBBS 10 mL を滅菌 H2O、7.5% NaHCO3の 0.47 μ L と EDTA 最終濃度 10 mM で 90 mL に追加することによって Ca なし 1 x HBBS を準備します。氷の上には、ソリューションを格納します。 1 x コラゲナーゼ D ソリューションを準備するには、18 mL の合計を確認するために Ca と HBBS 13 mL にコラゲナーゼ D ストック溶液 5 mL を追加します。氷の上には、ソリューションを格納します。注: は、実験の日に 2.5-2.7 の手順に記載されているソリューションを準備します。 3. ファブリキウス (BF) の除去 後部ハッチ鶏適切な承認された施設と人道的カリングそれらを 2-3 週齢で。注: は、カリング研究所承認メソッドを使用します。 無菌技術を使用して各鶏から BF を収集します。注: は、機関の場所でプロトコルを使用します。 背臥床に死体を置き、皮膚、70% エタノール、水で希釈した溶液で腹部と胸部を覆う羽を滅菌します。 滅菌メスやはさみを使用して下腹部の腹側正中切開を行います。 ファブリキウス、コロン、頭蓋腔に尾側部に接続されているを見つけます。 滅菌鉗子、はさみ、ファブリキウス コロンから無料のカットを使用します。腸を刺さないように注意してください。 冷 PBS でオルガンを置き、氷の上研究室にそれを転送します。注: 初代培養細胞は、臓器収穫後できるだけ早く隔離されなければなりません。 4. 鶏一次ファブリキウス嚢細胞の分離 BF の少なくとも 3 を洗って微生物学的安全キャビネットでの作業 30 mL の冷 PBS で x。 シャーレ (直径 21 mm 高さ 92 mm) に組織を移し、1 x D コラゲナーゼ溶液 5 mL を加えなさい。 使用滅菌ハサミやメスの刃は、直径 5 mm 以下の BF を切る。 37 ° C で 30 分間周期の穏やかな攪拌で組織を孵化させなさい。注: 組織を消化するコラゲナーゼの解決が開始されます。 組織の崩壊を促進する混合物を吸引繰り返し滅菌パスツール ピペットを使用する。必要な場合は、組織を小さな断片に切断します。 組織に 1 x コラゲナーゼ D ソリューションの別の 5 mL を追加し、別の 30 分の周期の穏やかな攪拌と 37 ° C でインキュベートします。 組織は完全に消化されるまでは、4.6 および 4.7 の手順を繰り返します。注: さらに溶解しない小顆粒があります。 100 μ m の細胞のストレーナーを Ca なし 1 x HBBS 20 mL に細胞懸濁液を通過します。 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心します。 上澄みを廃棄し、1 の 10 mL にペレットを再懸濁します 5% の FCS と x RPMI。 か 5 mL polysucrose、ナトリウム diatrizoate を含む密度勾配メディアの上に細胞懸濁液 10 mL をオーバーレイ、アンダーレイの 10 mL の細胞懸濁液の下に密度勾配メディアの 5 mL。2 つの明確なインターフェイスがあることを確認します。 遠心分離機の 4 ° C で 20 分間 900 x gでオーバーレイ下げるか、遠心分離機の区切りを削除します。注: セルは、セル メディアと密度勾配メディア間のインターフェイスでバンドを結成する必要があります。 滅菌パスツール ピペットを使用すると、セルを削除し、冷 PBS で配置します。洗浄セル 3 x 400 x gで 5 分でそれらを遠心分離して冷 PBS でそれらを再します。 5. 鶏主ファブリキウス嚢細胞の培養 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心し、完全 IMDM × 1 でそれらを再懸濁します。 細胞懸濁液の因数を取り出してトリパン ブルー色素ソリューションに追加トリパン ブルー色素を除外する実行可能なセルの数をカウントします。細胞および実行可能性の割合の数を決定します。 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心し、1:20 と補われる完全な IMDM でそれを再懸濁します 1 x 10 の7セル/ml の密度で鶏 CD40L の希薄化。1:10 に 1:50 の範囲にある可能性が高い、最適な希釈を決定する chCD40L を含む集中して上清を滴定しなさい。 48-72 宏 U 底 96 ウェル プレート平底プレートすることが望ましいためいずれかの 96 ウェルまたは 24 板 37 ° C での細胞を培養します。注: 40 ° C で細胞を培養もできます。 6. 鶏 IBDV と一次性ファブリキウス嚢細胞の感染症 48-72 時間後の分離、ウイルス、渦、サンプルの因数を解凍し、氷の上保存します。 一次性ファブリキウス嚢細胞を再懸濁します、細胞懸濁液の分注 10 μ L を取る、トリパン ブルー溶液 10 μ L を追加、細胞および実行可能性の割合の数を決定します。 1 感染症ウイルスと渦に (MOI) の適切な多重度を完全な IMDM x ウイルスを希釈します。 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心します。 上澄みを除去し、ウイルスの接種材料の細胞を再懸濁します。 定期的な撹拌で 1 h の 37 ° C の細胞懸濁液を孵化させなさい。 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心分離ウイルスの接種材料を削除し、完全な IMDM メディア x 1 のセルを洗浄します。 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心、上清を除去、完全な IMDM 培地 1 mL あたり 1 x 10 の7セルの密度で鶏 CD40L の細胞を再懸濁します。 37 ° C でいずれかの 96-24 ウェル プレートでの細胞を培養します。注: 40 ° C で細胞を培養もできます。 7. 鶏主のファブリキウス嚢細胞で IBDV レプリケーションの定量化 目的の時点の感染後に細胞を再懸濁します、適切なチューブに移して、5 分 400 × gで遠心分離機のそれらおよびプラクの試金またはリード Muench に従って、TCID50アッセイによって滴定ウイルス上清を収穫法15。 1 mL の PBS のセルを洗浄し IBDV に抗体で免疫染色のいずれかにそれらを準備または (製造元の指示に従って) 適切なキットを使用して RNA を抽出し、逆のトランスクリプションの量的なポリメラーゼ チェーンを実行反応 (RT qPCR) を使用して (前方、GAGGTGGCCGACCTCAACT; IBDV 遺伝子特定のプライマー逆に、GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)。モック感染培養細胞は、コントロールとして使用する必要があります。