An <em>Ex Vivo</em> Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Katherine L. Dulwich; Amin S. Asfor; Alice G. Gray; Venugopal Nair; Andrew J. Broadbent

doi:10.3791/58489

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Published: October 04, 2018

doi:

10.3791/58489

Katherine L. Dulwich*¹, Amin S. Asfor*¹, Alice G. Gray¹, Venugopal Nair¹, Andrew J. Broadbent¹

¹The Pirbright Institute

Summary

כאן נתאר את הבידוד של עוף תאים bursal העיקרי של פבריציוס של בורסה, התרבות, זיהום של התאים בוירוס bursal מחלה זיהומית, כימות של שכפול ויראלי.

Abstract

וירוס מחלה זיהומית bursal (IBDV) הוא birnavirus חשיבות כלכלית ענף העופות. הנגיף מדביק תאים B, גורם תחלואה, תמותה, החיסוני עופות נגועים. במחקר זה, אנו מתארים את הבידוד של עוף תאים bursal העיקרי של פבריציוס של בורסה, התרבות, זיהום של התאים עם IBDV, כימות של שכפול ויראלי. התוספת של עוף CD40 ליגנד גדל באופן משמעותי התפשטות תאים פי ארבעה יותר משש ימים של תרבות, הכדאיות תא המשופר. שני זנים של IBDV, תא-תרבות הותאם זן D78, זן מדבק מאוד, UK661, לשכפל גם בתרבויות שמחוץ לתא. מודל זה יהיה שימוש בקביעת כיצד התאים מגיבים IBDV זיהום, יאפשרו צמצום במספר של עופות נגועים שימוש במחקרים פתוגנזה IBDV. המודל יכול גם להיות מורחבת לכלול וירוסים אחרים, יכול לחול על מינים שונים של ציפורים.

Introduction

ענף העופות העולמי חיונית כדי להבטיח מספיק אוכל עבור אוכלוסיה אנושית מתרחבת. עם זאת, החיסוני היא האיום על ביטחון תזונתי ועל רווחת ציפורים מושפעת ומייצגת אתגר כלכלי מפתח לתעשיית. ברוב המקרים של החיסוני בעופות נגרמות על ידי הזיהום עם וירוסים לדיכוי המערכת החיסונית, עם האחראים ביותר ופוגע חסינות נרכשת לאחר tropism של לימפוציטים T ו- B¹. ציפורים, הרוב המכריע של תאים B ממוקמים בתוך איבר המכונה את פבריציוס של בורסה (BF). B תאים רגישים לזיהומים עם מספר וירוסים לדיכוי המערכת החיסונית, כולל אלה הגורמות פירוק, כגון וירוס מחלת IBDV ו של מארק (MDV), ואלה לגרום שינוי צורה, כגון וירוס leukosis העופות (אלב) ו- (וירוס reticuloendotheliosis REV).

על מנת לפתח אסטרטגיות יותר לשליטה זיהומים אלה, זה חיוני כדי לאפיין את האינטראקציה של וירוסים עם עוף B תאים. עם זאת, כאשר תאים B יוסרו ציפור, לא שורדות היטב שמחוץ תרבות², ומקשה על ביצוע ניתוח מעמיק של האינטראקציות של IBDV עם עוף B תאים או האירועים בתחילת בעקבות זיהום אלב או REV. כתוצאה מכך, רבים מארח תא-וירוס אינטראקציות כבר למדה ויוו³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^, ¹⁰. מחקרים אלה אמנם אינפורמטיבי, הם כוללים השימוש של עופות נגועים אשר סובלים ממחלות כי עלולות להיות חמורות.

ליגנד CD40 הוא מולקולה שגורם תא B הפצת¹¹. בעקבות זיהוי של העוף קידוד גנטי CD40L (chCD40L), תוכנן חלבון מסיס פיוז’ן, בעת הוספת התקשורת תרבות, המושרה ההתפשטות של עוף ראשי B תאים שמחוץ¹². בשנת 2015, נמצאו תאים B תרבותי בצורה הזאת כדי לתמוך את השכפול של MDV² ובשנת 2017, אנחנו ואחרים מצאו כי תאים bursal הראשית ממריצים עם chCD40L יכול לשמש כמודל ללמוד IBDV שכפול¹³^,¹⁴. כאן, אנו מתארים את הבידוד, התרבות של תאים bursal הראשית עוף, הזיהום של התאים עם IBDV, כימות של שכפול ויראלי. למרות נתאר שיטת בהקשר של BF, זה יכול להיות מיושם לתאי בידוד והתרבות של איברי הלימפה שונים.

Protocol

כל ההליכים עם חיות אתית לאשר מראש. במוסד שלנו, כל הפרוצדורות מתבצעות על פי החוק בבריטניה חיה (וצפייה) 1986 תחת רשיונות הקמת המשרד הביתי, אישי ופרויקטים, לאחר האישור של צער פנימי, לוח ביקורת אתית (AWERB). 1. הכנת chCD40L תרבות HEK 293-msCD8-CD40L תאים stably אקספרס chCD40L מסיסים לבנות 1 x המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני בתוספת 10% חום-לא פעיל (שלום) בסרום עגל עוברית (FCS) ו- 1 puromycin µg/mL ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2.הערה: תאים אלה זמינים ממכון Pirbright לאחר החתימה על הסכם העברת חומר מתאים. פצל את התאים-צפיפות 1:5 כאשר confluent. לאסוף תגובת שיקוע (מכיל הבונה chCD40L מסיסים) בכל התאים מתחלקים, centrifuge זה ב x 400 g עבור 5 דקות כדי הסרת לכלוך הסלולר, ואחסן אותו ב 4 º C. כאשר 500 מ”ל של תגובת שיקוע נאסף, בריכה הנוזל, מסנן-לעקר אותה דרך פילטר מיקרומטר 0.2. לרכז את תגובת שיקוע באמצעות ריכוז חלבון צנטריפוגלי עם ניתוק משקל מולקולרי של 10 K לפי הוראות היצרן. לחלץ את תגובת שיקוע מרוכזת של כל עמודה, מאגר זה ביחד, מסנן-לעקר אותה על ידי העברתו דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לקבוע את הריכוז הסופי כדי לשמש בניסויים, באופן סדרתי דילול הפתרון chCD40L 1 של x Iscove שונה של Dulbecco בינוני (IMDM) (שלב שמתואר 2.4) ותאים culturing ראשי bursal בנוכחות דילולים. לקבוע את מספר ואחוז הכדאיות של התאים מדי יום במשך שבוע.הערה: הריכוז הנמוך ביותר שבו התפשטות תאים ואת הכדאיות סבירים הוא ריכוז כדי להשתמש בוזמינותו. . זה עשוי להיות בין 1:20 ו- 1:50. 2. הכנה של פתרונות לבידוד ראשי תא Bursal עוף להכין 1 x הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBBS) עם סידן (Ca) על-ידי הוספת 10 מ”ל של x HBBS 10 עם Ca 90 מיליליטר סטרילי H2O ו- 0.47 µL של 7.5% NaHCO3. להכין collagenase D מניות פתרון 8 מ ג/מ ל 1 x HBBS עם לחטא-Ca. מסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 µM.הערה: מומלץ להכין aliquots מ ל, להקפיא אותם ב-20 ° C. להכין 1 בינוני x RPMI בתוספת 5% שלום FCS. חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין 1 x 500 מ של IMDM בתוספת 8% שלום FCS, 2% שלום תרנגולת סרום, 50 מ מ β-mercaptoethanol, µL 50 של אינסולין-transferrin-נתרן-סלניט, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס.הערה: להכין מראש את כל הפתרונות הנ. להכין x HBBS 1 עם Ca. החנות הפתרון על קרח. להכין x HBBS 1 ללא רשות על-ידי הוספת 10 מ”ל של x HBBS 10 ללא Ca 90 מיליליטר סטרילי H2O, µL 0.47 של 7.5% NaHCO3, ו- EDTA-ריכוז סופי של 10 מ מ. אחסן את הפתרון על קרח. להכין 1 x collagenase D פתרון על-ידי הוספת 5 מ של פתרון מניות collagenase D 13 מיליליטר HBBS עם Ca כדי סך של 18 מ. אחסן את הפתרון על קרח.הערה: להכין את הפתרונות שהוזכרו בשלבים 2.5-2.7 ביום של הניסוי. 3. הסרת פבריציוס של בורסה (BF) תרנגולות אחורי, הפתח במתקן המתאים, שאושרו, בצורה הומאנית ללקט אותם רוב בגיל 2-3 שבועות.הערה: השתמש בשיטות שאושרו על-ידי המכון על שגרפה לידיה. לאסוף את BF כל תרנגולת באמצעות טכניקות aseptic.הערה: השתמש הפרוטוקולים במקום במוסד. הכנס את הגווייה recumbency הגבי, לחטא את העור ואת נוצות בשכבת-על החזה והבטן עם פתרון של 70% אתנול, מדולל במים. עושים חתך הגחון קו האמצע בבטן התחתונה באמצעות אזמל מעוקר או מספריים. אתר את פבריציוס של בורסה, אשר מחובר אל המקטע סימטרית של המעי הגס, הגולגולת פתח ביב. באמצעות מלקחיים סטיריליים ומספריים, לחתוך את פבריציוס של בורסה חינם של המעי הגס. לטפל כדי למנוע ניקב את הבטן. למקם את האיבר PBS קר ולהעביר אותו למעבדה על קרח.הערה: תאים העיקרי צריך להיות מבודד בהקדם האפשרי לאחר הקציר איברים. 4. בידוד תאי Bursal הראשית עוף עובד ב- cabinet, ביטחון מיקרוביולוגית לשטוף את BF לפחות 3 x ב- 30 מ של PBS קר. להעביר את הרקמה צלחת פטרי (92 מ”מ קוטר, 21 מ מ גובה), הוסף 5 מ של פתרון collagenase D ‘ x 1 ‘. באמצעות מספריים סטרילי או להב סכין לחתוך את BF לחתיכות של פחות מ 5 מ מ קוטר. דגירה הרקמה ב 37 ° C עם עצבנות עדין תקופתיים למשך 30 דקות.הערה: הפתרון collagenase תתחיל לעכל את הרקמה. שוב ושוב באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר, וארוקן את התערובת כדי לעודד התפוררות של הרקמה. במידת הצורך, את הרקמות לחתוך לחתיכות קטנות יותר. להוסיף עוד 5 מ ל 1 x collagenase D פתרון הרקמה, דגירה זה ב 37 ° C עם עצבנות עדין תקופתיים למשך עוד 30 דקות. חזור על שלבים 4.6 ו- 4.7 עד הרקמה מתעכלת לחלוטין.הערה: יהיו גרגירים קטנים אשר אינם מתמוססים עוד יותר. עוברים התליה תא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך 20 מ של x HBBS 1 ללא רשות. Centrifuge התליה תא ב x 400 g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 10 מ”ל של 1 x RPMI עם 5% FCS. כיסוי 10 מ”ל של התליה תא מעל 5 מ של צפיפות הדרגתיות המדיה המכילה diatrizoate polysucrose ו נתרן או ביסוד 5 מ של צפיפות מדיה מעבר הצבע מתחת התליה תא 10 מ”ל. וודאו כי אין ממשק ברור בין השניים. Centrifuge את הכיסוי ב x 900 גרם במשך 20 דקות ב 4 º C. להוריד או להסיר את מעבר צנטריפוגה.הערה: התאים צריכים להקים להקה על הממשק בין תא המדיה והתקשורת הדרגתיות צפיפות. באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר, להסיר התאים ולמקם אותם ב- PBS קר. לשטוף את התאים 3 x צריך שתוציאו אותם ב x 400 g למשך 5 דקות, resuspending אותם ב- PBS קר. 5. התרבות של תאים Bursal הראשית עוף Centrifuge התליה תא ב x 400 g למשך 5 דקות, resuspend אותם ב- 1 x IMDM מלאה. . קח את aliquot של התליה תא, להוסיף את פתרון Trypan blue, לספור את מספר התאים קיימא השוללים את Trypan blue. לקבוע את מספר התאים ואת הכדאיות אחוז. Centrifuge התליה תא ב 400 x g למשך 5 דקות, resuspend אותו ב- IMDM מלאה בתוספת 1:20 דילול של עוף CD40L על צפיפות של עונה 1 פרק 107 תאים למ”ל. Titrate את תגובת שיקוע מרוכז המכיל את chCD40L כדי לקבוע דילול אופטימלית, אשר צפוי לשקר בטווח של 1:10 עד 1:50. התרבות התאים גם צלחות 96 – או 24-ובכן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48-72 ה’ להטלטל U 96-ובכן צלחות עדיפים על צלחות שהונעו.הערה: תאים יכולים גם להיות תרבותי ב 40 ° C 6. זיהום של תאים Bursal הראשית עוף עם IBDV 48-72 שעות לאחר בידוד, להפשיר aliquot של הווירוס, מערבולת המדגם, ואחסן אותו בקרח. Resuspend התאים bursal הראשית, לקחת 10-µL aliquot של התליה תא, להוסיף את µL 10 של פתרון Trypan blue, לקבוע את מספר התאים ואת הכדאיות אחוז. לדלל את הוירוס 1 x IMDM מלאה לריבוי הפנים המתאים של זיהום (MOI) כדי להפוך הוירוס inoculum מערבולת. Centrifuge התליה תא ב x 400 g למשך 5 דקות. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים inoculum וירוס. דגירה התליה תא ב 37 ° C עבור h 1 עם עצבנות תקופתיים. Centrifuge התליה תא ב x 400 g למשך 5 דקות, להסיר את inoculum וירוס, לשטוף את התאים 1 x מדיה IMDM מלאה. Centrifuge התליה תא ב 400 x g למשך 5 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים בתקשורת IMDM מלאה בתוספת עוף CD40L על צפיפות של תאי 1 x 107 מ. התרבות התאים גם צלחות 96 – או 24-ובכן-37 מעלות צלזיוס.הערה: תאים יכולים גם להיות תרבותי ב 40 ° C 7. כימות של שכפול IBDV בתאים Bursal הראשית עוף ב postinfection הרצוי נקודת זמן, resuspend את התאים, להעביר אותם הצינור המתאים, centrifuge אותם ב x 400 g למשך 5 דקות, לקצור את תגובת שיקוע עבור טיטור וירוס assay פלאק או TCID assay50 לפי ריד-Muench שיטת15. לשטוף את התאים 1 מ”ל ל- PBS, הכינו אותם גם עבור immunostaining עם נוגדן ספציפי IBDV, או לחלץ RNA באמצעות ערכת המתאים (בעקבות הוראות היצרן) ולבצע שרשרת של פולימראז כמותיים שעתוק במהופך התגובה (RT-qPCR) באמצעות תחל ספציפי ג’ין IBDV (לפנים, GAGGTGGCCGACCTCAACT; הפוך, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). תרביות תאים הנגועים ואימץ אמור לשמש בתור פקד.

Representative Results

עוף תאים Bursal ראשי יכול להיות תרבותי בנוכחות CD40L עוף כאשר תאים bursal הראשית עוף היו תרבותי בנוכחות chCD40L מסיסים, מספר התאים גדל פי ארבעה מן 9.02 x 105 3.63 x 106 לכל mL על פני תקופה של 6 ימים, בניגוד כשזה היה נעדר (p < 0.05) ( איור 1A). תא הכדאיות היה משמעותי גם משופר, לדוגמה מ- 25% על התרבות שלאחר יום 3 בהיעדרו של chCD40L ל- 48% בנוכחות chCD40L (p < 0.05) (איור 1B)13. תאים Bursal הראשית עוף יכול לתמוך את שכפול של שני תרבות-תא הותאם וללחצים מידבק מאוד של IBDV תרביות תאים הנגועים מעושה ולא נגוע תוקנו 18 h postinfection, שכותרתו עם נוגדן חד שבטי נגד IBDV VP2 של נוגדנים משניים מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 488, counterstained עם דאפי. תאים נגועים היו עדות פלורסצנטיות ירוק מסביב לגרעין (איור 2 א), עקבי עם הנוכחות של IBDV בציטופלסמה. . זה היה ניכר עבור שני זנים של IBDV, תא-תרבות הותאם זן D78, זן מדבק מאוד, UK661 (איור 2 א). בגיל חמש, 18, 24, 48 שעות postinfection, RNA שחולצו מן התרבויות נגוע, נתון RT-qPCR עם תחל ספציפי לאזור ההכפלה של הגן IBDV VP4. הביטוי של VP4 מנורמל הראשונה אל הגן משק בית TBP, המבוטא ואז מקפלים שינוי ביחס דגימות מעושה בניתוח ΔΔCt. הביטוי IBDV VP4 עלה ל 16,603 עותקים ב 48 שעות postinfection עם D78 ו 38,632 עותקים ב 48 שעות postinfection עם UK661. יחדיו, נתונים אלה מדגימים התאים bursal הראשית עוף יכול. לתמוך השכפול של התא-תרבות-הותאם והוא מידבק מאוד IBDV זנים13. איור 1: עוף תאים bursal ראשי יכול להיות תרבותי בנוכחות עוף CD40L. תאים bursal הראשית עוף היו תרבותי ב נוכחות או היעדרות של chCD40L (שחור וקווי לבן, בהתאמה). (א) מספר תאים חיים ו- (B) האחוז של התאים קיימא היו נחושים-postinfection הזמן המצוין-נקודות. הנתונים המוצגים הם נציג של פחות שלושה ניסויים שכפל קווי השגיאה לייצג סטיית התקן של הממוצע, מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות של תלמיד לזווג t-test בכל נקודה בזמן, * p < 0.05. איור זה שונתה באישור Dulwich. et al. 13. איור 2: עוף תאים bursal הראשי יכול לתמוך את השכפול של שניהם-תרבית תאים הותאם וללחצים מידבק מאוד של IBDV. (א) עוף תאים bursal העיקרי היו נגועים מעושה או נגוע או D78 או UK661, מדגם מתוך כל תרבות היה קבוע, שכותרתו, עם תמונה: IBDV VP2, ירוק. . רב-קוטבי, כחול סרגל קנה מידה = 7 מיקרומטר. (B) RNA שהופק ב postinfection הזמן המצוין-נקודות, הפוכה-עיבד, ואת אזור ההכפלה של הגן IBDV VP4 היה מוגבר על ידי ה-PCR כמותי. הקיפול10 יומן שינוי VP4 עותק מספר מנורמל ל הגן משק TBP והביע ביחס הנגועים ואימץ דוגמאות לפי שיטתΔΔCT –2. הנתונים המוצגים הם נציג לפחות שלושה ניסויים שכפל, קווי השגיאה לייצג סטיית התקן של הממוצע. דמות זו שונתה באישור Dulwich. et al. 13.

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים את התרבות מוצלחת של עוף ראשי תאים bursal ex-vivo בנוכחות chCD40L מסיסים, להדגים כי תאים אלה יכולים לתמוך את השכפול של זן הקלוש, זן מדבק מאוד של IBDV. מודל זה שמחוץ יכול לשמש כדי לקבוע כיצד התאים מגיבים IBDV זיהום¹³, אשר יש יתרונות ברורים על פני לימודים ב- vivo ו- in vitro לקשרי .

כאשר לקצור את BF, זה קריטי לא ידקור את הבטן כדי למנוע זיהום חיידקי של התאים bursal מבודדים. בנוסף, חשוב לבודד את התאים הראשי בהקדם האפשרי לאחר הקציר איברים להגבלת מוות של תאים. הצורך להשתמש chCD40L היא מגבלה של הטכניקה; עם זאת, עבודה שנערך על ידי. Soubies et al. מראה כי השימוש phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) להאריך את הכדאיות תא bursal במקום chCD40L¹⁴ עשוי לאפשר את המודל יאומץ על ידי מספר גדול יותר של מעבדות. פרוטוקול שפורטו לעיל קובע את ריכוז אופטימלי chCD40L מדעית, מאת culturing העיקרי בתאי B בריכוזים מדולל באופן סדרתי של מולקולה, התבוננות התפשטות תאים ואת הכדאיות. אחד פוטנציאלי שינוי בפרוטוקול יכול להיות לטהר את מולקולת chCD40L כדי להוסיף התקשורת התרבות התא כדי להימנע אצווה-כדי-אצווה השתנות ריכוז מסוים.

In vivo מחקרים הראו כי זיהום IBDV הבאים, שיש עלייה הביטוי של גנים המעורבים ציטוקינים פרו-דלקתיים תגובות תגובות סוג I IFN, אפופטוזיס ב BF⁵^,⁹^,¹⁰. עם זאת, לאחר ההדבקה, יש זרם של תאים דלקתיים ותאי אפקטור T לתוך BF, אשר נבדלים הגנים שהם מבטאים לעומת האוכלוסייה תא B נגוע⁹. לכן, קשה לפרש תאים כמה מזוהם, להגיב IBDV. כדי לטפל בבעיה זו, כמה קבוצות מחקר שאפיינו את התגובה תעתיק של תאים נגועים IBDV תרבות¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. מחקרים אלה במבחנה יש היתרון של MOIs מוגדרים היטב, בזמן נקודות postinfection. עם זאת, בדרך כלל כבר שאפיינו מחקרים במבחנה פיברובלסט תאים¹⁶^,¹⁷^,²⁰ או תאים דנדריטים¹⁸. בזמן מתן כמה תובנות מארח תא-IBDV אינטראקציות, האמונה הנוכחי הוא הזיהום של תאים B הוא תפקיד חשוב בפתוגנזה של IBDV ו, לכן, הרלוונטיות של הנתונים לא יכול להיות overinterpreted. לפני שמחוץ לתא bursal תרבות המודל שלנו, מחקר אחד רק היה מאופיין התגובה התאית של תאים B IBDV זיהום¹⁹; עם זאת, מחקר זה מנוצל קו מונצחים תא B זה הפך עקב זיהום עם אלב, הגבלת את המסקנות זה יכול להיעשות. לעומת זאת, הדגם ex-vivo של זיהום IBDV המתוארים כאן מאפשר לחוקרים לשמר את היתרונות של מחקרים במבחנה , כגון MOIs והמוגדרים בזמן נקודות, תוך כדי לימוד את האינטראקציות של הנגיף עם התא המארח הרלוונטיות שלה. כמו התאים bursal הראשית מתקבלים מרקמות BF נגוע, ישנם לא דלקתית או תאי T הנוכחי, ואנחנו הפגינו על ידי flow cytometry (באמצעות תנאים סטנדרטיים), גירוי chCD40L הבאים, 97% מהאוכלוסיה התא הוא חיובי עבור סמן תא B Bu-1 (נתונים לא מוצג). בהתחשב בכך 3% של התאים הם Bu-1 שלילי, זה יהיה מעניין לקבוע אם תאים אלה נדבקים בנגיף IBDV לחקור את ביטוי גנים והתרומה שלהם בפתוגנזה.

אנו צופים כי המודל התרבות vivo לשעבר ראשי תא bursal עוף ניתן להרחיב גם ללמוד את האינטראקציות תא-וירוס מחשב מארח של וירוסים טרופי אחרים B-cell מדביק תרנגולות, כגון אלב או REV, יכול גם להיות מורחבת אחרים (מינים העופות למשל, ברווזים או תרנגולי הודו). היכולת התרבות תאים bursal הראשית שמחוץ גם פותח את האפשרות ללמוד היבטים של פתוגנזה ו החיסוני הנגרמת על ידי וירוסים אלה ללא צורך להדביק ציפורים. כפי ויוו מחקרים לגרום תחלואה משמעותית, זאת תהיה השפעה משמעותית על החלפת, עידון, הפחתת השימוש בבעלי חיים במחקר.

לסיכום, שמחוץ עוף תא bursal ראשי תרבות המודל המתואר כאן יש פוטנציאל להרחיב את ההבנה של איך העופות B-cell טרופי וירוסים אינטראקציה עם התאים המארחים תוך הפחתת מספר ציפורים בשימוש vivo מחקרים זיהום. ניתן ליישם את הטכניקות איברי הלימפה מרובים, מרובים, ווירוסים, באופן פוטנציאלי, מספר מינים של ציפורים, שהופך אותו מודל אטרקטיבי אשר יכולים לתרום השדות העופות וירולוגיה ואימונולוגיה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות לצוות שירותים בעלי חיים במכון Pirbright המומחיות שלהם הבקיעה לגידול, ליקוט ציפורים והמומחיות של קרוליין הולט בהסרת גילוח ורחיצה כירורגית של פבריציוס של בורסה. א. ב ממומנת באמצעות ביוטכנולוגיה ולהעניק המועצה למחקר מדעי ביולוגיים (BBSRC) באמצעות BBS/E/אני/00001845, ארגז ממומן דרך BBSRC דרך studentship BBS/E/אני/00002115, א. א ממומנת באמצעות המרכז הארצי החלפת, עידון & הפחתת של חיות מחקר (NC3Rs) באמצעות מענק NC/R001138/1.

Materials

RPMI-1640 Medium	Merck	R8758-500ML
FBS	gibco by Life Technologies	10099-141	heat-inactivate at 56°C for 1 hour
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113802
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane	Thermo Fisher Scientific	168-0045
Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml)	Thermo Fisher Scientific	88528
0.22µm Millex-GP Syringe Filter	Merck	F7648
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2	gibco by Life Technologies	14060-040
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) – CaCl2 – MgCl2	gibco by Life Technologies	14180-046
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA)	Merck	03690-100ML
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX	gibco by Life Technologies	31980-030
Chicken Serum	Merck	C5405-100ML
2-Mercaptoethanol 50mM	gibco by Life Technologies	31350-010
insulin-transferrin-sodium-selenite	gibco by Life Technologies	41400-045
Collagenase D	Roche Diagnostics GmbH	11088882001
100µm Cell Strainer	Corning	431752
Histopaque-1083	Merck	10831-100ML
Trypan Blue solution	Merck	T8154-20ML
Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Fisher Scientific	163320
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile	Corning	353047
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104

References

Hoerr, F. J. Clinical aspects of immunosuppression in poultry. Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).
Schermuly, J., et al. In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).
Farhanah, M. I., et al. Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology. , (2018).
Farhanah, M. I., et al. Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus. Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).
Guo, X., et al. Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus. Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).
He, X., et al. Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence. In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).
Ou, C., et al. Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases. Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).
Rasoli, M., et al. Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus. BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).
Ruby, T., et al. Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection. Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).
Smith, J., et al. Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease. Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).
Tregaskes, C. A., et al. Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate. Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).
Kothlow, S., et al. CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture. Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).
Dulwich, K. L., et al. Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV). Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).
Soubies, S. M., et al. Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells. Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).
Reed, L., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).
Hui, R. K., Leung, F. C. Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus. PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).
Li, Y. P., et al. Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus. Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).
Lin, J., et al. Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease. BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).
Quan, R., et al. Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus. Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).
Wong, R. T., et al. Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays. Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Dulwich, K. L., Asfor, A. S., Gray, A. G., Nair, V., Broadbent, A. J. An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis. J. Vis. Exp. (140), e58489, doi:10.3791/58489 (2018).

Automatically Generated

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below