Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K
Summary
Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является недвусмысленным метод измерения свободных радикалов. Использование селективного спин зондов позволяет для обнаружения свободных радикалов в различных клеточных отсеках. Мы представляем практический и эффективный метод для сбора биологических проб, которые облегчают обработки, хранения и передачи образцы для измерения ОРЭД.
Abstract
Точным и конкретным обнаружение реактивнооксигенных видов (ров) в разных отсеках, клеточные и тканевые имеет важное значение для изучения редокс регулируемых сигнализации в биологических параметров. Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является единственным прямым методом однозначно оценить свободных радикалов. Его преимущество заключается в том, что он обнаруживает физиологических уровнях конкретных видов с высокой точностью, но он требует специализированной технологии, тщательно пробоподготовки и соответствующие элементы управления для обеспечения точной интерпретации данных. Циклические гидроксиламина спин зонды избирательно реагируют с супероксид или другие радикалы для генерации сигнала nitroxide, которые могут быть количественно методом ЭПР спектроскопии. Ячейки проницаемой спин зонды и спин датчики предназначены для накопления быстро в митохондриях позволяют для определения концентрации супероксид в различных клеточных отсеках.
В культивируемых клеток, использование клеток проницаемых 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) наряду с и без предварительной обработки клеток непроницаемый супероксид дисмутаза (SOD) или использование клеток проницаемой PEG-SOD, позволяет дифференциация внеклеточного от цитозольной супероксида. Митохондриальной 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium дихлорид (mito темп-H) позволяет для измерения митохондриальной Рось (преимущественно супероксиддисмутаза).
ЭПР спектроскопии и спин зонды также может применяться к моделям в естественных условиях . Супероксид могут быть обнаружены в внеклеточной жидкости, крови и альвеолярной жидкости, а также ткани, такие как легочной ткани. Несколько методов представлены для обработки и хранения тканей для измерений ОРЭД и доставки внутривенных 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) спина зонд в естественных условиях. Во время измерения могут быть выполнены при комнатной температуре, образцы, полученные in vitro и in vivo модели также могут быть хранятся при температуре-80 ° C и проанализированы по ОРЭД в 77 K. Образцы можно хранить в специализированных трубы стабильной температуре-80 ° C и работать на 77 K чтобы практическая, эффективную и воспроизводимый метод, который облегчает хранение и передача образцов.
Introduction
Меры оксидативного стресса и реактивнооксигенных видов имеют важное значение для изучения различных заболеваний во всех органов и систем, обнаружение реактивнооксигенных видов (ров) является сложной задачей из-за короткий период полураспада и высокую реакционную способность. Электронного парамагнитного резонанса (EPR) техника является самым недвусмысленным метод для обнаружения свободных радикалов. Спин зонды имеют преимущества над более часто используемых флуоресцентных зондов. Хотя флуоресцентных зондов, относительно недорогой и простой в использовании и обеспечивают быстрый, чувствительность обнаружения ROS, они имеют серьезные ограничения, обусловленные артефакты сигналов, неспособность рассчитать концентрации рос и общее отсутствие конкретности1 .
Для облегчения использования ОРЭД для биологических исследований, различные датчики были синтезированы спина, что можно измерить широкий спектр видов биологически соответствующих свободных радикалов, а также ро2, pH и редокс государств2,3, 45,,6,7. Также были разработаны спин ловушки для захвата недолго радикалов и формы долгоживущие аддукты, который облегчает обнаружение по ОРЭД8. Оба класса (спин зондов и спин ловушки) имеют свои преимущества и ограничения. Один из часто используемых класс спин зонды являются циклических Гидроксиламины, которые НРА молчаливый и реагировать с недолгим радикалы для формирования стабильной nitroxide. Циклические Гидроксиламины реагируют с супероксид 100 раз быстрее, чем спин ловушки, что позволяет им конкурировать с сотовой антиоксидантов, но они неконкретны и требуют использования надлежащего контроля и ингибиторов для идентификации радикальной видов или источник ответственный за nitroxide сигнала. В то время как спина ловушки экспонат специфичности, с различных спектральных шаблонов в зависимости от захваченных видов, они имеют медленно кинетики супероксид спина треппинга и подвержен биодеградации радикала аддукты. Приложений для треппинга спин были хорошо документированы в биомедицинских исследований9,10,11,12,13.
Целью этого проекта является демонстрация практических методов ОРЭД для проектирования экспериментов и подготовка образцов для обнаружения супероксида с помощью спин зонды в различных клеточных отсеков в пробирке и в различные ткани отсеков в естественных условиях. Несколько рукописей были опубликованы протоколы соответствующих для этих целей, с использованием клеток проницаемой, клетки непроницаемый и митохондриальной целевых спин зонды для различных клеточных отсеков в пробирке и процесс ткани-мишени для анализа в модели мыши 14 , 15. Мы строим на этот орган литературы, проверяя подход к супероксиддисмутаза, используя 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine зонд спин (CMH) в различных клеточных отсеков в пробирке для обеспечения точного измерения измерения, подчеркнув потенциальные технические проблемы, которые могут исказить результаты. Мы также предоставляют методы для выполнения измерений ОРЭД в крови, Бронхоальвеолярный лаваж жидкости и легочной ткани с помощью зонда спин КМЗ. Эти исследования сравнить разные методы для обработки тканей, а также метод придать еще один спин зонд, CPH, мышей до уборки ткани. Наконец мы разрабатываем практический метод для хранения образцов труб из политетрафторэтилена (ПТФЭ) для хранения и передачи образцов до измерения ОРЭД в 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оценка производство свободных радикалов в биологических параметров имеет важное значение в понимании редокс регулируется сигнализации в здоровье и болезни, но мера этих видов является очень сложным из-за короткий период полураспада видов свободных радикалов и технического ограниче?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана университета Колорадо школы медицины Дин стратегической инфраструктуры исследований премии, R01 HL086680-09 и 1R35HL139726-01, E.N.G. и UCD CFReT стипендия, (он). Авторы благодарят д-р Сандра Eaton и доктор Гарет Eaton (Денверский университет), д-р Джеральд Розен и д-р Джозеф P. Као (Университет штата Мэриленд) и доктор Суджатха Венкатараман (Университет штата Колорадо Денвер) для полезной дискуссии и Джоан Maltzahn, Эшли Trumpie и Ivy Макдермотт (Университет штата Колорадо Денвер) для технической поддержки.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
