Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K
Summary
Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è un metodo univoco per misurare i radicali liberi. L’utilizzo di sonde di spin selettiva permette per la rilevazione dei radicali liberi in diversi compartimenti cellulari. Presentiamo un metodo pratico, efficiente per raccogliere campioni biologici che facilitano il trattamento, l’archiviazione e trasferire campioni per misure di EPR.
Abstract
La rilevazione accurata e specifica delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) in diversi compartimenti cellulari e tessutali è essenziale per lo studio di redox-regolati segnalazione in impostazioni biologiche. Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è il metodo solo diretto per valutare in modo non ambiguo i radicali liberi. Il suo vantaggio è che rileva i livelli fisiologici di specifiche specie con un’alta specificità, ma richiede tecnologia specializzata, preparazione del campione attento e controlli appropriati per garantire la corretta interpretazione dei dati. Sonde di spin ciclico idrossilammina reagiscono selettivamente con superossido o altri radicali per generare un segnale di nitrossidi che possa essere quantificato mediante spettroscopia EPR. Sonde di spin cellula-permeabile e sonde di spin progettati per accumulare rapidamente nei mitocondri consentono la determinazione della concentrazione di superossido in diversi compartimenti cellulari.
In cellule coltivate, l’uso di 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeabili delle cellule (CMH) lungo con e senza pretrattamento di cella-impermeabile superossido dismutasi (SOD) o uso di PEG-SOD cellula-permeabile, consente la differenziazione di extracellulare da superossido citosolico. Il 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondriale] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permette la misura di ROS mitocondriale (principalmente superossido).
Sonde di spin e spettroscopia EPR possono essere applicati anche ai modelli in vivo . Superossido può essere rilevato in fluidi extracellulari quali il sangue e liquido alveolare, così come tessuti, come tessuto polmonare. Diversi metodi sono presentati per elaborare e conservare il tessuto per misurazioni di EPR e consegnare endovenosa 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) rotazione sonda in vivo. Mentre le misure possono essere eseguite a temperatura ambiente, campioni ottenuti da modelli in vitro e in vivo possono essere conservati a-80 ° C e analizzati da EPR a 77 K. I campioni possono essere memorizzati in stalla tubi specializzati a-80 ° C ed eseguiti a 77 K per consentire un pratico, efficiente e metodo riproducibile che facilita la memorizzazione e trasferimento di campioni.
Introduction
Mentre misure dello sforzo ossidativo e specie reattive dell’ossigeno sono importanti per lo studio di diverse malattie attraverso tutti i sistemi dell’organo, la rilevazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) è difficile a causa di una breve emivita e alta reattività. Una tecnica di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) dell’elettrone è il metodo più inequivocabile per la rilevazione dei radicali liberi. Sonde di spin hanno vantaggi rispetto le sonde fluorescenti più comunemente utilizzati. Se sonde fluorescenti sono relativamente poco costoso e facile da usare e fornire rilevamento rapido, sensibile di ROS, hanno gravi limitazioni a causa di segnali artifactual, un’incapacità di calcolare le concentrazioni di ROS e una generale mancanza di specificità1 .
Per facilitare l’uso di EPR per gli studi biologici, una varietà di sonde sono stati sintetizzati di spin che può misurare una gamma di specie del radicale libero biologicamente rilevanti nonché pO2, pH e redox afferma2,3, 4,5,6,7. Trappole di spin sono stati sviluppati anche per catturare i radicali di breve durati e durata di vita-forma addotti, che facilita la rilevazione di EPR8. Entrambe le classi (sonde di spin e spin traps) hanno vantaggi e limitazioni. Una classe comunemente usata di sonde di spin sono idrossilammine ciclici, che sono EPR-silent e reagiscono con i radicali di breve durati per formare un nitrossidi stabile. Ciclici idrossilammine reagiscono con superossido 100 volte più veloce di spin trappole, consentendo loro di competere con gli antiossidanti cellulari, ma manca di specificità e richiedono l’uso di adeguati controlli e inibitori per identificare l’origine o specie radicaliche responsabile per il segnale di nitrossidi. Mentre spin intrappola espositivo specificità, con distinte spettrale che modelli a seconda della specie intrappolata, hanno cinetica lenta per spin trapping e sono incline a biodegradazione del radicale del superossido addotti. Applicazioni per il trapping spin sono state ben documentate nella ricerca biomedica9,10,11,12,13.
L’obiettivo di questo progetto è quello di dimostrare metodi EPR pratici per la progettazione di esperimenti e preparazione dei campioni per rilevare superossido utilizzando spin sonde in diversi compartimenti cellulari in vitro e nei compartimenti differenti del tessuto in vivo. Alcuni manoscritti sono pubblicati protocolli pertinenti a questi obiettivi, usando sonde di cellula-permeabile, impermeabile cellulare e mitocondriale spin mirati al tessuto bersaglio diversi compartimenti cellulari in vitro e processo per l’analisi in modelli murini 14 , 15. costruiamo su questo corpo di letteratura convalidando un approccio per misurare superossido utilizzando una sonda di spin (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine in diversi compartimenti cellulari in vitro per garantire accurata misurazioni, evidenziando potenziali problemi tecnici che possono falsare i risultati. Forniamo anche metodi per effettuare misurazioni di EPR in sangue, fluido di lavaggio broncoalveolare e tessuto polmonare utilizzando la sonda di spin CMH. Questi studi confrontare diversi metodi per elaborare i tessuti, nonché di presentare un metodo per iniettare un’altra sonda di spin, CPH, topi prima della raccolta del tessuto. Infine, sviluppare un metodo pratico per conservare i campioni in tubi di politetrafluoroetilene (PTFE) per consentire l’archiviazione e il trasferimento dei campioni prima di misurazioni EPR a 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
La valutazione della produzione di radicali liberi nelle impostazioni biologiche è importante nella comprensione regolato segnalazione redox in salute e malattia, ma la misura di queste specie è estremamente impegnativo a causa della breve emivita di specie del radicale libero e tecnici limitazioni con metodi comunemente utilizzati. L’EPR è uno strumento prezioso e potente in biologia redox, poichè è il metodo solo non ambiguo per la rilevazione dei radicali liberi. In questo progetto, dimostriamo metodi EPR pratici…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla University of Colorado at Scuola di medicina Dean di infrastrutture di ricerca strategiche award, R01 HL086680-09 e 1R35HL139726-01, al E.N.G e UCD CFReT premio fellowship (lui). Gli autori ringraziano il Dr. Sandra Eaton e Dr. Gareth Eaton (Università di Denver), Dr. Gerald Rosen e Dr. Joseph P. Kao (Università del Maryland), Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) per utili discussioni e Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie e Ivy McDermott (University of Colorado Denver) per il supporto tecnico.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
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