השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K
Summary
ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.
Abstract
זיהוי מדויק וספציפי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתאים הסלולר ורקמות שונים חיוני למחקר של חמצון-חיזור מוסדר איתות בהגדרות ביולוגי. ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא השיטה רק ישיר כדי להעריך רדיקלים חופשיים חד משמעית. היתרון שלו הוא שהוא מזהה רמות הפיזיולוגיות של מינים ספציפיים עם ירידה לפרטים גבוה, אבל זה דורש טכנולוגיה מיוחדת, הכנת הדוגמא זהיר, ולהבטיח הפקדים המתאימים לפירוש מדויק של הנתונים. Hydroxylamine מחזורית ספין הגששים להגיב באופן סלקטיבי סופראוקסיד או אחרים רדיקלים ליצירת אות nitroxide זה ניתן לכמת על ידי EPR ספקטרוסקופיה. ספין תא חדיר הגששים וזונדים ספין שנועד לצבור במהירות בתוך המיטוכונדריה לאפשר קביעת ריכוז סופראוקסיד בתאים הסלולר שונה.
תאים בתרבית, השימוש הסלולרי חדיר 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) יחד עם וללא תא אטום סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) רעלני או השימוש תא חדיר פג-SOD, מאפשר הבידול של חוץ-תאי של סופראוקסיד cytosolic. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido מיטוכונדריאלי] piperidinium dichloride (mito-טמפו-H) מאפשר מדידה של ROS מיטוכונדריאלי (בעיקר סופראוקסיד).
ניתן להחיל ספין הגששים וספקטרוסקופיה EPR גם למודלים ויוו . סופראוקסיד יכול להתגלות חוץ-תאית נוזלים כגון דם ונוזלי מכתשי, כמו גם רקמות כגון רקמת הריאה. מספר שיטות מוצגים לעבד, לאחסן רקמות למדידות EPR ולהעביר תוך ורידי 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) ספין המקדח בתוך vivo. בזמן מדידות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, המתקבל במבחנה ויוו דגמים יכול גם להיות מאוחסן ב- 80 ° C ודוגמאות נותחו על ידי EPR-77 K… הדגימות יכול להיות מאוחסנת באורווה צינורות מיוחדים ב-80 מעלות צלזיוס ולהפעיל ב K 77 כדי לאפשר מעשית, יעיל, ושיטה לשחזור מקלה על אחסון, העברת דגימות.
Introduction
בעוד אמצעים של סטרס חמצוני, מינים חמצן תגובתי חשובים בחקר מחלות מגוונות בכל מערכות איברים, הגילוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) הוא מאתגר עקב מחצית חיים קצר תגובתיות גבוהה. טכניקת פאראמגנטיים תהודה (EPR) אלקטרון הוא השיטה ברורה וחד משמעית ביותר לגילוי רדיקלים חופשיים. ספין הגששים יש יתרונות על פני הגששים פלורסנט הנפוצות. למרות הגששים פלורסנט הם יחסית זול וקל להשתמש ולספק גילוי מהיר, רגיש של ROS, יש להם מגבלות רציניות בשל אותות מלאכותית, חוסר יכולת לחשב ריכוזים ROS, וחוסר כללי ירידה לפרטים1 .
כדי להקל על השימוש של EPR עבור מחקרים ביולוגיים, מגוון רחב של ספין הגששים היו מסונתז שיכול למדוד מגוון מינים רדיקלים חופשיים ביולוגית רלוונטית וכן פו2, pH וחמצון-חיזור קובע2,3, 4,5,6,7. ספין מלכודות גם פותחו כדי ללכוד רדיקלים קצרת ימים, טופס ארוך-חי adducts, אשר מאפשר זיהוי על ידי EPR8. שני המעמדות (ספין הגששים ומלכודות ספין) יש יתרונות ומגבלות. שיעור נפוץ אחד של הגששים ספין הם hydroxylamines מחזורית, אשר EPR-שקט ו להגיב עם רדיקלים קצרת ימים כדי ליצור nitroxide יציב. Hydroxylamines מחזורית להגיב עם סופראוקסיד 100 פעמים מהר יותר מאשר מלכודות ספין, ומאפשרת להם להתחרות עם נוגדי חמצון הסלולר, אך הם חוסר ירידה לפרטים, דורשים שימוש הפקדים המתאימים, כדי לזהות את המינים רדיקלי או מקור אחראית על האות nitroxide. בעוד ספין מלכודות ירידה לפרטים מוצג עם ברורים ספקטרלי שדפוסי בהתאם המינים לכוד, יש להם קינטיקה איטי סופראוקסיד ספין השמנה, נוטים כילוי של הקיצוני adducts. יישומים עבור ספין השמנה כבר מתועדת היטב המחקר הביו-רפואי9,10,11,12,13.
המטרה של הפרויקט הזה היא להדגים שיטות מעשיות EPR לעיצוב ניסויים, הכנת דוגמאות כדי לזהות סופראוקסיד באמצעות ספין רגשים תאים סלולריים שונים בתוך חוץ גופית , רקמות שונות תאים ויוו. מספר כתבי יד פרסום פרוטוקולים רלוונטיים מטרות אלה, באמצעות ספין יישוב חדיר התא, התא אטום, מיטוכונדריאלי הגששים לרקמות היעד תאים סלולריים שונים במבחנה ואת תהליך לניתוח במודלים של העכבר 14 , 15. אנחנו בונים על הגוף הזה של הספרות על-ידי אימות גישה כדי למדוד סופראוקסיד באמצעות בדיקה ספין (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine תאים סלולריים שונים במבחנה כדי להבטיח מדויק מדידות, סימון בעיות פוטנציאליות טכני אשר עשויים להטות את תוצאות. כמו כן, אנו מספקים שיטות לביצוע מדידות EPR ב דם נוזל שטיפה bronchoalveolar, רקמת הריאה באמצעות המכשיר ספין CMH. מחקרים אלה השוואה בין שיטות שונות כדי לעבד את הרקמות, כמו גם להציג שיטה להזריק עוד ספין הגישוש, CPH, לתוך עכברים לפני קצירת רקמות. לבסוף, אנו מפתחים שיטה מעשית כדי לאחסן דגימות אבובים טפלון (PTFE) כדי לאפשר אחסון והעברת דגימות לפני EPR מדידות-77 K…
Protocol
Representative Results
Discussion
הערכת ייצור רדיקלים חופשיים בהגדרות ביולוגי חשוב להבין חמצון-חיזור מוסדר איתות על בריאות ומחלה, אבל המדד של המינים הללו הוא מאוד מאתגר בשל זמן מחצית החיים הקצר של רדיקלים חופשיים מינים וטכני מגבלות עם השיטות הנפוצות. EPR הוא כלי חשוב ורב עוצמה בביולוגיה חמצון-חיזור, כמו גם את שיטת ברורה וחד …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר באוניברסיטת קולורדו של רפואה דין פרס תשתיות מחקר אסטרטגי, R01 HL086680-09, 1R35HL139726-01, כדי E.N.G. ו- UCD CFReT מלגת פרס (הוא). המחברים תודה ד ר סנדרה איטון, ד ר גארת איטון (באוניברסיטת דנבר), ד ר ג’רלד רוזן, ד ר יוסף עמ’ קאו (אוניברסיטת מרילנד), ד ר תהיה ונקאטרמאן (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) דיונים מועילים ואני ג’ואן Maltzahn, אשלי Trumpie, אייבי מקדרמוט (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
