Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K
Summary
Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.
Abstract
A detecção precisa e específica de espécies reativas de oxigênio (ROS) em diferentes compartimentos celulares e tecidos é essencial para o estudo de redox-regulado sinalização nas configurações biológicas. Espectroscopia de ressonância paramagnética de electrões (EPR) é o método direto apenas para avaliar os radicais livres de forma inequívoca. Sua vantagem é que ele detecta níveis fisiológicos das espécies específicas com uma elevada especificidade, mas requer tecnologia especializada, preparação cuidadosa da amostra e controlos adequados para garantir a exata interpretação dos dados. Sondas de rotação cíclica de hidroxilamina reagem seletivamente com superóxido ou outros radicais para gerar um sinal de nitroxide que pode ser quantificado por espectroscopia de EPR. Sondas de rotação célula-permeável e sondas de rotação projetadas para acumular rapidamente nas mitocôndrias permitem a determinação da concentração de superóxido em diferentes compartimentos celulares.
Em culturas de células, o uso de célula permeável 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) junto com e sem pré-tratamento de célula-impermeável superóxido dismutase (SOD) ou uso de célula-permeável PEG-SOD, permite a diferenciação de extracelular de superóxido citosólico. O 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidínico dicloreto (mito-ritmo-H) permite a medição de ROS mitocondrial (predominantemente superóxido).
Sondas de rotação e espectroscopia EPR também podem ser aplicados aos modelos na vivo . Superóxido pode ser detectado em líquidos extracelulares como o sangue e fluido alveolar, bem como os tecidos como o tecido pulmonar. Vários métodos são apresentados para processar e armazenar tecido para medições de EPR e entregar intravenosa 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) rotação sonda em vivo. Enquanto as medições podem ser executadas em temperatura ambiente, as amostras obtidas de modelos in vitro e in vivo também podem ser armazenadas a-80 ° C e analisadas pelo EPR em 77 K. As amostras podem ser armazenadas no estábulo de tubos especializados a-80 ° C e executadas em 77 K para habilitar um prático, eficiente e o método reprodutível que facilita o armazenamento e transferência de amostras.
Introduction
Enquanto medidas de estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio são importantes para o estudo de diversas doenças em todos os sistemas do órgão, a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um desafio devido a uma meia-vida curta e alta reatividade. Uma técnica de ressonância paramagnética (EPR) do elétron é o método mais inequívoco para a detecção de radicais livres. Sondas de rotação têm vantagens sobre as sondas fluorescentes mais comumente usadas. Apesar de sondas fluorescentes são relativamente baratos e fáceis de usar e fornecer detecção rápida e sensível de ROS, têm sérias limitações devido a sinais diferente, a incapacidade de se calcular as concentrações de ROS e uma falta geral de especificidade1 .
Para facilitar o uso de EPR para estudos biológicos, uma variedade de spin sondas foram sintetizadas que pode medir uma gama de espécies radicalares biologicamente relevantes, bem como pO2, pH e redox afirma2,3, 4,5,6,7. Armadilhas de rotação também foram desenvolvidas para capturar radicais de curta duração e vida longa forma adutos, que proporciona a detecção por EPR8. Ambas as classes (sondas de girar e girar armadilhas) têm vantagens e limitações. Uma classe comumente usado de sondas de rotação são hidroxilaminas cíclicas, que são o EPR-silencioso e reagem com os radicais de curta duração para formar um nitroxide estável. Hidroxilaminas cíclicas reagem com superóxido 100 vezes mais rápido do que as armadilhas de rotação, permitindo-lhes competir com antioxidantes celulares, mas eles carecem de especificidade e requerem o uso de controles apropriados e inibidores para identificar a espécie radical ou fonte responsável pelo sinal nitroxide. Enquanto a rotação armadilhas especificidade de exposição, com distintas espectral de que padrões, dependendo da espécie presa, eles têm cinética lenta para superóxido spin trapping e são propenso a biodegradação do radical adutos. Pedidos de interceptação de rotação foram bem documentados em investigação biomédica9,10,11,12,13.
O objetivo deste projeto é demonstrar métodos práticos de EPR para projetar experiências e preparação de amostras para detectar superóxido, usando a rotação sondas em diferentes compartimentos celulares in vitro e em tecidos diferentes compartimentos na vivo. Diversos manuscritos publicaram protocolos relevantes para esses objetivos, utilizando sondas de rotação alvo permeável ao celular, celular-impermeáveis e mitocondrial ao tecido alvo diferentes compartimentos celulares in vitro e processo para análise em modelos do rato 14 , 15. vamos construir sobre este corpo de literatura, Validando uma abordagem para medir superóxido usando uma sonda de rotação (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine em diferentes compartimentos celulares em vitro para garantir precisão medições, destacando possíveis problemas técnicos que podem distorcer os resultados. Nós também fornecemos métodos para realizar medições de EPR em sangue, líquido de lavagem broncoalveolar e tecido pulmonar usando a sonda de rotação CMH. Estes estudos podem comparar diferentes métodos para processar os tecidos, bem como apresentar um método para injetar outra sonda de rotação, CPH, em ratos antes da colheita de tecidos. Finalmente, nós desenvolvemos um método prático para armazenar as amostras em tubos de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir o armazenamento e transferência de amostras antes de medições de EPR em 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
A avaliação da produção de radicais livres em configurações biológicas é importante em redox de compreensão regulamentada a sinalização na saúde e na doença, mas a medida destas espécies é altamente desafiadora devido a meia-vida curta de espécies radicalares e técnica limitações com métodos comumente usados. EPR é uma ferramenta poderosa e valiosa em biologia redox, como é o método somente inequívoco para a detecção de radicais livres. Neste projeto, demonstramos métodos práticos de EPR para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela escola de medicina do reitor award de infra-estrutura de pesquisa estratégica, R01 HL086680-09 e 1R35HL139726-01, a E.N.G. e UCD CFReT prêmio de fellowship (ele) Universidade do Colorado. Os autores graças a Dr. Sandra Eaton e Dr. Gareth Eaton (Universidade de Denver), Dr. Gerald Rosen e Dr. Joseph P. Kao (Universidade de Maryland) e Dr. Sujatha Venkataraman (Universidade de Colorado Denver) para discussões úteis e Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie e Ivy McDermott (Universidade de Colorado Denver) para suporte técnico.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
