Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)
Summary
Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.
Abstract
Este método permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue infectado. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação do parasita permite serológico e investigações de pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense. Tripanosomas relacionadas são os agentes causadores da tripanossomíase animal. Detecção de tripanossoma é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de chapéu. A técnica descrita aqui é a técnica de deteção de parasita mais sensível, adaptada às condições de campo para o diagnóstico de T. b. gambiense chapéu e pode ser concluída no prazo de uma hora. Sangue é mergulhado em uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) previamente ajustada ao pH 8 e tampão de eluição é adicionado. Altamente negativamente carregados de glóbulos são adsorvidos na coluna Considerando que atravessam as tripanosomas menos negativamente carregadas. Tripanosomas coletadas peletizadas por centrifugação e observadas por microscopia. Além disso, parasitas preparam-se, sem dano celular, embora mantendo sua infecciosidade.
Tripanosomas purificadas são necessárias para testes imunológicos; Eles são usados no ensaio de trypanolysis, o padrão-ouro na serologia de chapéu. Manchado de parasitas são utilizadas no teste de aglutinação de cartão (CATT) para sorologia de campo. Antígenos de tripanosomas purificadas, como a glicoproteína de superfície variante, exoantigens, também são utilizados em diversos imunoensaios. O procedimento descrito aqui é projetado para tripanosomas africanas; por conseguinte, condições cromatográficas tem que ser adaptado para cada estirpe tripanossoma e mais geralmente, para o sangue de cada espécie de hospedeiro mamífero.
Estas fascinantes patógenos são facilmente purificada e disponíveis para uso em bioquímicos, moleculares e estudos de biologia, incluindo co-cultura com células hospedeiras para investigar relações hospedeiro-parasita a nível dos receptores de membrana, sinalização e gene da pilha expressão; drogas testes em vitro; investigação de exclusão genética, mutação ou superexpressão em processos metabólicos, a biogênese do citoesqueleto e a sobrevivência do parasita.
Introduction
O método apresentado descrito aqui, permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação de parasita permite robusto inquérito sorológico e pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense1. Estes protozoários parasitas multiplicam extracelularmente no sangue, linfa e líquidos intersticiais durante a primeira fase da doença (estágio hemolinfático). O segundo estágio (meningoencephalitic) começa quando parasitas atravessam a barreira hemato-encefálica; sinais neurológicos, incluindo um distúrbio do sono, que deu o seu nome “doença do sono” para esta doença, são típicos deste segundo estágio2. Tripanosomas relacionadas (T. evansi, T. congolensee, T. vivax, T. b. brucei) são os agentes causadores de animal tripanossomose Africana (AAT)3.
A Organização Mundial de saúde (OMS) tem como objetivo eliminar o chapéu como um problema de saúde pública até 2020 e para parar a transmissão por 20304. A recente introdução de testes de diagnóstico rápido tem melhorado diagnóstico sorológico1,4,5. Foram desenvolvido vários testes de diagnóstico molecular, mas seu papel no diagnóstico de campo ainda não foi estabelecido5. Eles são usados para identificar as sub-espécies do grupo brucei e tripanossomíase atípica causada por parasitas responsáveis pela tripanossomose animal6.
A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento, como serologia pode dar resultados falsos positivos e infelizmente falso negativo1. A observação microscópica direta destes protistas hemoflagelado é difícil nos casos de chapéu que são causados por T. b. gambiense, (mais de 95% dos casos) como parasitemias baixas são a regra, Considerando que para chapéu causada por T. b. rhodesiense, um grande número de parasitas está frequentemente presente no sangue. Várias técnicas de concentração têm sido utilizadas, tais como a gota espessa e centrifugação do tubo capilar (CTC), mas a separação de parasitas do sangue por uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) seguido de centrifugação e observação microscópica do pellet, é o método mais sensível (cerca de 50 parasitas/mL de sangue pode ser detectado)1,7. Consequentemente, a purificação de tripanosomas por esse método de ânion-trocadores (celulose DEAE) é o melhor e, até à data, o método de referência para visualização e isolando os parasitas do sangue para o diagnóstico de chapéu. Em condições de campo, uma mini coluna de celulose DEAE tem sido utilizada com sucesso e várias melhorias facilitaram a observação microscópica7,8.
O método de separação de tripanossoma do sangue, descrito abaixo, depende a carga superficial do parasita, que é menos negativa do que células de sangue de mamíferos9. Curiosamente, este método foi desenvolvido há 50 anos atrás, em 1968 pelo Dr. Sheila Lanham e continua a ser o padrão ouro para detecção e preparação de tripanosomas da corrente sanguínea. É rápido e reprodutível para salivarian tripanosomas de uma grande variedade de mamíferos, permitindo o diagnóstico de ambos tripanossomíase humana e animal,10.
Para obter vida, purificadas de parasitas, sangue infectado é adicionado em uma coluna de permutador de aniões. Condições cromatográficas (principalmente pH, força iônica de amortecedores/mídia) têm de ser adaptadas a cada espécie de tripanossoma e mais geralmente, para cada combinação de células de sangue de mamíferos e tripanosomas10. Tampão de eluição é precisamente ajustada ao pH de 8 para mais africano tripanosomas10. Esse método favorece a concentração de parasitas no sangue dos pacientes, porque parasitemias pode ser muito baixa para ser detectada por observação microscópica sozinha, e também permite a exames laboratoriais. Trabalhar com tripanosomas recém isoladas e no sangue de animais infectados, usando esta técnica, é mais pertinente para diversas investigações do que os estudos com parasitas que têm sido cultivadas em condições de axénica no laboratório por um período indeterminado.
Relações hospedeiro-parasita são mais bem estudadas com um parasita a infectar seu hospedeiro natural, portanto, T. disponibilizado, um parasita murino natural, que é representante de tripanosomas extracelulares, tem muitas vantagens como infecção murino envolve-se em um animal de laboratório pequeno e não requer condições de nível (BSL) de segurança de risco biológico. T. disponibilizado não mata camundongos imunocompetentes, ao contrário de muitas outras espécies de Trypanosoma , incluindo patógenos humanos. T. disponibilizado não são eliminadas em ratos privados de células T e parasitemias pode ser aumentada em ratos infectados, modificando a ingestão de alimentos e nutrientes11. Este parasita modula a resposta imune em co-infecções com outros patógenos12. T. disponibilizado de diferenças de exposição de ratos infectados de culta T. disponibilizado, por exemplo, a expressão de receptores de membrana Fc é perdida em culturas de axénica T. disponibilizado , em comparação com parasitas purificadas de ratos infectados13 , 14. fatores secretados por Excreted (FSE) também são qualitativa e quantitativamente menos expressos em culturas de tripanossoma axénica e diferem entre as cepas isoladas em áreas endêmicas15. ESF são os antígenos primeiros a ser exibido para o sistema imunológico do hospedeiro e portanto desempenham um papel importante no acolhimento inicial da resposta imune16.
Em animais experimentalmente infectados para exames laboratoriais, este protocolo facilita a experimentação em um número maior de parasitas, minimizando o número de ratos necessárias especialmente ao utilizar animais imunossuprimidos. As glicoproteínas de superfície variantes (VSGs) que são usadas no teste de aglutinação de cartão para tripanossomíase (CATT) em triagem em massa ainda são purificadas de tripanosomas que são propagadas em ratos. Os dois testes diagnósticos rápidos (cassettes embrulhados individualmente) que agora estão disponíveis para uso no campo, ainda estão usando uma fonte infecciosa modelo de nativo VSGs e não em vitro cultivadas tripanosomas1,4, 5. o avanço no estudo da imunologia tripanossoma e biologia tem sido facilitado, desde que estes DEAE celulose purificada parasitas podem ser facilmente obtidas em grandes quantidades de hospedeiros naturalmente ou experimentalmente infectados e em particulares, roedores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tripanosomas purificadas representam um meio poderoso para estudar imunologia, bioquímica, celular e biologia molecular. Grandes extensões de dados e os resultados foram obtidos de tripanosomas, que então tem ajudado a obter informações de outras células eucarióticas30. Tripanosomas são também objecto de investigação importante e interessante porque eles criaram numerosos mecanismos que lhes permitam sobreviver e crescer em dois ambientes muito diferentes: o vetor mosca tsé-tsé e o ho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros do UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento interno da Universidade de Bordeaux e apoio da ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 e da Associação pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e o serviço de Coopération et d’Action culturelle de L’Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
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