تنقية مثقبيات خارج الخلية، بما في ذلك البلدان الأفريقية، من الدم بشاردة-مبادلات (ديثيلامينوثيل-السليلوز أعمدة)
Summary
هذا الأسلوب من المثقبيات انفصال الدم يعتمد على تهمة السطحية يجري أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم. وضع الدم الملوث ويعامل على عمود مبادل شاردة. يوفر هذا الأسلوب، الأكثر ملائمة في التشخيص لداء المثقبيات الأفريقي، الطفيليات المنقي للتحقيقات المناعية، والبيولوجية، والكيميائية الحيوية، الصيدلة والبيولوجيا الجزيئية.
Abstract
هذا الأسلوب يتيح فصل مثقبيات، الطفيليات المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (قبعة)، من الدم الملوث. وهذا هو أفضل طريقة لتشخيص المرحلة الأولى قبعة وعلاوة على ذلك هذا الأسلوب تنقية الطفيلي تصاريح المصلية والبحوث التحقيقات.
قبعة بسبب ذبابة التسي تسي أحال المثقبيات البروسية الغامبية و رهوديسينسي ت.. مثقبيات ذات الصلة هي العوامل المسببة لداء المثقبيات الحيواني. الكشف عن المثقبيات ضروري للقبعة التشخيص والعلاج والمتابعة. الأسلوب الموصوفة هنا هو أسلوب الكشف عن الطفيليات الأكثر حساسية، تتكيف مع الظروف الميدانية لتشخيص الغامبية ت. قبعة ويمكن أن تنجز في غضون ساعة واحدة. الطبقات الدم على عمود مبادل شاردة (دي السليلوز) سبق تعديلها لدرجة الحموضة 8، وتتم إضافة شطف المخزن المؤقت. مشحونة سلبا على درجة عالية من خلايا الدم هي تمتز فوق العمود بينما يمر مثقبيات مشحونة بأقل تأثيراً سلبيا. مثقبيات جمعها القريبون من الطرد المركزي والتقيد بالفحص المجهري. وعلاوة على ذلك، تعد الطفيليات دون الأضرار الخلوية مع الحفاظ على هذه العدوى.
مثقبيات المنقي مطلوبة لاختبار المناعية؛ وتستخدم في الفحص تريبانوليسيس، معيار الذهب في الأمصال قبعة. الطفيليات الملون تستخدم في اختبار تراص بطاقة (كات) لحقل علم الأمصال. مولدات المضادات من مثقبيات المنقي، مثل بروتين سكري السطحي البديل، اكسوانتيجينس، تستخدم أيضا في تحديدكم المختلفة. ويهدف الإجراء الموضح هنا المثقبيات الأفريقي؛ ونتيجة لذلك، يضطر شروط الفصل اللوني لتكييفها لكل سلالة المثقبيات، وبشكل أعم، للدم من كل الأنواع من الثدييات المضيفة.
هذه رائعة مسببات الأمراض سهولة المنقي ومتاحة للاستخدام في الجزيئي، والكيمياء الحيوية وخلية دراسات علم الأحياء بما في ذلك ثقافة المشارك مع الخلايا المضيفة للتحقيق في علاقات الطفيلي المضيف على مستوى مستقبلات الغشاء، والإشارات، والجينات التعبير؛ المخدرات في المختبرمن الاختبار؛ التحقيق حذف الجينات أو طفرة أو overexpression على العمليات الأيضية ونشوء حيوي سيتوسكيليتال وبقاء الطفيلي.
Introduction
طريقة عرض وصف هنا يسمح فصل مثقبيات، الطفيليات المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (قبعة) من الدم. وهذا هو أفضل طريقة لتشخيص المرحلة الأولى قبعة وعلاوة على ذلك يسمح هذا الأسلوب تنقية الطفيلي التحقيق المصلية وبحوث قوية.
قبعة بسبب ذبابة التسي تسي أحال المثقبيات البروسية الغامبية و rhodesiense ت1. تتكاثر هذه الطفيليات الأوالي اكستراسيلولارلي في مجرى الدم والليمفاوية، وسوائل الخلالي خلال المرحلة الأولى من المرض (المرحلة هيموليمفاتيك). تبدأ المرحلة الثانية (مرحلة مينينجونسيفاليتيك) عند الطفيليات عبور حاجز الدم في الدماغ؛ علامات عصبية، بما في ذلك اضطراب نوم، التي أعطت لهذا المرض باسم “مرض النوم”، نموذجية لهذه المرحلة الثانية2. مثقبيات ذات الصلة (افانسي ت.، النشيطة ت. ت. ب-البروسية، كونجولينسي ت.) هي العوامل المسببة للحيوان المثقبيات الأفريقي (محكمة الاستئناف الإدارية)3.
وتهدف منظمة الصحة العالمية (WHO) للقضاء على قبعة كمشكلة من مشاكل صحة العامة بحلول عام 2020، والتوقف عن الإرسال بحلول عام 20304. وقد الأخذ في الآونة الأخيرة من اختبارات التشخيص السريع تحسين التشخيص المصلية1،،من45. وضعت العديد من الاختبارات التشخيصية الجزيئية ولكن دورها في مجال التشخيص لم المنشأة5. يتم استخدامها لتحديد الأنواع الفرعية للمجموعة البروسية وداء المثقبيات شاذة الناجمة عن الطفيليات المسؤولة عن المثقبيات الحيواني6.
الكشف عن الطفيليات ضروري للتشخيص والعلاج والمتابعة، كما علم الأمصال يمكن أن تعطي نتائج سلبية كاذبة إيجابية وكاذبة للأسف1. الملاحظة المباشرة تقنيين من الاولانيات هيموفلاجيلاتي هذه يصعب في حالات القبعة التي تسببها الغامبية. ت.، (أكثر من 95% حالات) كما باراسيتيمياس المنخفضة هي القاعدة، بينما للقبعة الناجمة عن ت. رهوديسينسي، كبير عدد الطفيليات موجودة غالباً في الدم. وقد استخدمت تقنيات تركيز مختلفة، مثل إسقاط سميكة والأنبوبة الشعرية الطرد المركزي (مكافحة الإرهاب)، ولكن فصل الطفيليات من الدم بعمود شاردة-مبادل (دي السليلوز) متبوعاً بالطرد المركزي والمراقبة المجهرية بيليه، وهو الأسلوب الأكثر حساسية (ويمكن الكشف عن الطفيليات حوالي 50 مليلتر من الدم)1،7. ونتيجة لذلك، هو تنقية مثقبيات بهذا الأسلوب شاردة-مبادلات (السليلوز دي) الأفضل، وحتى هذا التاريخ، أسلوب المرجع لتصور وعزل الطفيليات من الدم لتشخيص القبعة. في الظروف الميدانية، عمود صغير من السليولوز دي قد استخدمت بنجاح وسهلت العديد من التحسينات الملاحظة تقنيين7،8.
يعتمد الأسلوب الفصل المثقبيات من الدم، المبينة أدناه، في مقابل سطح الطفيلي، الذي أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم9. من المثير للاهتمام، هذا الأسلوب قد وضعت قبل 50 عاماً، في عام 1968 بالدكتورة شيلا لنهام، ويظل معيار الذهب للكشف وإعداد مثقبيات مجرى الدم. فسريع واستنساخه مثقبيات ساليفاريان من مجموعة واسعة من الثدييات، وتسمح بتشخيص داء المثقبيات الحيوانية والبشرية على حد سواء10.
للحصول على الطفيليات الحية، وتنقية، تتم إضافة الدم المصاب على عمود مبادل شاردة. الظروف اللوني (أساسا درجة الحموضة، القوة الأيونية للمخازن المؤقتة/وسائل الإعلام) لها لكي تلائم كل الأنواع المثقبيات، وبصورة أعم، كل مزيج من الثدييات خلايا الدم ومثقبيات10. يتم ضبط العازلة شطف تحديداً على درجة الحموضة 8 لمعظم الأفارقة مثقبيات10. هذا الأسلوب يفضل تركيز الطفيليات في الدم للمرضى، ونظرا لأن باراسيتيمياس يمكن أن تكون منخفضة للغاية للكشف عنها بواسطة المراقبة المجهرية وحدها، وكما أنها تمكن الفحوص المختبرية. العمل مع مثقبيات طازجة المعزولة وفي الدم من الحيوانات المصابة باستخدام هذا الأسلوب، أكثر صلة بالموضوع للتحقيقات المختلفة من الدراسات مع الطفيليات التي قد تم مثقف في ظروف أكسينيك في المختبر لأجل غير مسمى.
علاقات الطفيلي المضيف يتم دراسة أفضل مع طفيلي إصابة المضيف الطبيعي، ولذلك، ت. موسكولي، طفيلي مورين طبيعية، وهو ممثل مثقبيات خارج الخلية، مزايا عديدة تنطوي الإصابة مورين في الحيوانات المختبرية الصغيرة ولا تتطلب واقية شروط السلامة المستوى (BSL). موسكولي ت. لا تقتل الفئران الأشخاص، خلافا لكثير من الأنواع مثقبيه الأخرى، بما فيها مسببات الأمراض البشرية. لا يتم القضاء موسكولي ت. في الفئران المحرومين من خلية تي ويمكن زيادة باراسيتيمياس في الفئران المصابة بتعديل كمية الغذاء والمغذيات11. ينظم هذا الطفيلي الاستجابة المناعية في التهابات المشارك مع مسببات الأمراض الأخرى12. هو التعبير عن مستقبلات Fc غشاء موسكولي ت من الفئران المصابة معرض الاختلافات من مثقف ت. موسكولي، على سبيل المثال، فقدت في الثقافات موسكولي ت. أكسينيك، مقارنة بالطفيليات تنقيته من الفئران المصابة13 , 14-العوامل التي تفرز اكسكريتيد (كلية العلوم التربوية) هي أيضا نوعيا وكمياً أقل المعرب عنه في الثقافات المثقبيات أكسينيك وتختلف بين السلالات المعزولة في15من المناطق الموبوءة. كلية العلوم التربوية هي المستضدات الأولى عرض لاستضافة الجهاز المناعي وذلك تلعب دوراً هاما في المضيف الأولى الاستجابة المناعية16.
ويسهل هذا البروتوكول في الحيوانات المصابة تجريبيا للفحوص المختبرية، التجريب على عدد أكبر من الطفيليات، والتقليل من عدد الفئران المطلوبة لا سيما عند استخدام الحيوانات إيمونوسوبريسيد. لا يزال يتم تنقيته glycoproteins السطحي البديل (فسجس) التي يتم استخدامها في “اختبار تراص بطاقة” “داء المثقبيات” (كات) في الفحص الشامل من المثقبيات التي تم نشرها في الفئران. هما الاختبارات التشخيصية السريعة (شرائط ملفوفة على حدة) التي أصبحت الآن متاحة للاستخدام في الميدان، تزال تستخدم مصدر معدية نموذج أصلي فسجس ولا في المختبر مثقف مثقبيات1،4، 5. وقد تيسر النهوض بالدراسة من المثقبيات علم المناعة وعلم الأحياء منذ هذه الطفيليات السليلوز تنقية دي يمكن بسهولة الحصول على كميات كبيرة من المضيفين المصابة طبيعيا أو تجريبيا، وفي القوارض خاصة،.
Protocol
Representative Results
Discussion
مثقبيات المنقي تمثل وسيلة قوية لدراسة علم المناعة، والكيمياء الحيوية، والخلوية والبيولوجيا الجزيئية. وحصلت مساحات كبيرة من البيانات والنتائج من المثقبيات، ثم مما ساعد على الحصول على المعلومات من خلايا حقيقية النواة الأخرى30. مثقبيات هي أيضا موضوع بحوث هامة ومثيرة للاهتمام ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع أعضاء 177 قاسم أغا إينتيرتريب سيراد IRD جامعة بوردو دي. هذا البحث كان يدعمها التمويل الداخلي من جامعة بوردو والدعم من وكالة الاستخبارات الوطنية، لابيكس ANR بارافراب-11-لابكس-0024، والرابطة من أجل le التنمية de la البحوث في باراسيتولوجي et تروبيكال الطب والخدمات التعاون والعمل الثقافي de لعمباسادي à فرنسا دي بانغي (أفريقيا الوسطى).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
