Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)
Summary
Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.
Abstract
Este método permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (sombrero) de sangre infectada. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite serológica e investigación las investigaciones.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense. Relacionados con tripanosomas son los agentes causativos de tripanosomiasis animal. Detección de tripanosoma es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de sombrero. La técnica descrita aquí es la técnica de detección de parásito más sensible, adaptada a condiciones de campo para el diagnóstico de T. b. gambiense sombrero y puede ser completada dentro de una hora. Es capas de sangre sobre una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) previamente ajustada a pH 8, y se añade tampón de elución. Cargadas altamente negativa de las células sanguíneas son adsorbidas en la columna mientras que los tripanosomas menos negativamente cargadas pasan a través. Tripanosomas recogidos son peleteados por centrifugación y observados por microscopia. Por otra parte, parásitos están preparados sin daño celular manteniendo su infectividad.
Tripanosomas purificadas se requiere para las pruebas inmunológicas; se utilizan en el análisis de trypanolysis, el estándar de oro para serología de sombrero. Tinción de parásitos se utilizan en la prueba de aglutinación de la tarjeta (CATT) para serología de campo. Antígenos de tripanosomas purificados, como la glicoproteína variante de superficie, exoantígenos, también se utilizan en diferentes inmunoensayos. El procedimiento descrito aquí está diseñado para tripanosomas africanos; en consecuencia, tienen condiciones de cromatografía para adaptarse a cada cepa de Tripanosoma y más generalmente, a la sangre de cada especie de mamífero anfitrión.
Estos fascinantes patógenos son fácilmente purificada y disponible para usar en Bioquímica, molecular y estudios de la biología incluyendo co-cultivo con células hospedadoras para investigar las relaciones huésped-parásito en el nivel de receptores de membrana, la señalización y el gen de la célula expresión; la droga de prueba in vitro; investigación de canceladura del gene, mutación o sobreexpresión de procesos metabólicos, biogénesis del citoesqueleto y supervivencia del parásito.
Introduction
El método se describe aquí permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (HAT), de la sangre. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite sólida investigación serológica y la investigación.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense1. Estos parásitos protozoarios se multiplican extracelularmente en el torrente sanguíneo, linfa y líquidos intersticiales durante la primera etapa de la enfermedad (etapa hemolinfáticos). La segunda etapa (etapa meningoencephalitic) comienza cuando parásitos cruzan la barrera hematoencefálica; signos neurológicos, incluyendo un trastorno del sueño, que ha dado su nombre “enfermedad del sueño” a esta enfermedad, son típicas de esta segunda etapa2. Relacionados con tripanosomas (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) son los agentes causativos de animal Tripanosomosis Africana (AAT)3.
La Organización Mundial de la salud (OMS) tiene como objetivo eliminar el sombrero como un problema de salud pública de aquí a 2020 y detener la transmisión por 20304. La reciente introducción de pruebas de diagnóstico rápido tiene mejor diagnóstico serológico1,4,5. Se han desarrollado varias pruebas diagnóstico moleculares, pero su papel en el diagnóstico de campo aún no ha sido establecido5. Se utilizan para identificar las sub-especies del grupo brucei y tripanosomiasis anormal causada por parásitos responsables de la Tripanosomosis animal6.
La detección del parásito es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento, como la serología puede dar resultados falsos positivos y por desgracia falsos negativos1. La observación microscópica directa de estos protistas hemoflagelados es difícil en los casos de sombrero que son causados por T. b. gambiense, (más de 95% de los casos) como bajas parasitemias son la regla, considerando que para sombrero causada por T. b. rhodesiense, una gran número de parásitos está con frecuencia presente en la sangre. Se han utilizado varias técnicas de concentración, como la gota gruesa y centrifugación del tubo capilar (CTC), pero la separación de los parásitos de la sangre por una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) seguido por centrifugación y observación microscópica de la pellet, es el método más sensible (alrededor de 50 parásitos/mL de sangre puede detectarse)1,7. En consecuencia, la purificación de tripanosomas por este método de intercambiadores de aniones (DEAE celulosa) es el mejor y hasta la fecha, el método de referencia para visualizar y aislar parásitos de la sangre para el diagnóstico de sombrero. En condiciones de campo, una pequeña columna de DEAE celulosa se ha utilizado con éxito y varias mejoras han facilitado la observación microscópica7,8.
El método de separación de tripanosoma de sangre, que se describe a continuación, depende de la carga superficial del parásito, que es menos negativo que el mamífero células de sangre9. Curiosamente, este método fue desarrollado hace 50 años, en 1968 por el Dr. Sheila Lanham y sigue siendo el estándar de oro para la detección y preparación de tripanosomas de la sangre. Es rápido y reproducible para tripanosomas salivarian de una amplia gama de mamíferos, permitiendo el diagnóstico de ambos de tripanosomiasis animal y humana10.
Para obtener vida, purificados de parásitos, sangre infectada se agrega en una columna de intercambiador de aniones. Condiciones de cromatografía (principalmente pH, fuerza iónica de tampones y medios) tienen que adaptarse a cada especie de Tripanosoma y más generalmente, para cada mezcla de mamíferas células de sangre y tripanosomas10. Tampón de elución es precisamente ajustado a pH 8 por tripanosomas africanos más10. Este método favorece la concentración de parásitos que se encuentran en la sangre de los pacientes, porque parasitemias pueden ser demasiado bajos para ser detectados por observación microscópica solamente, y también permite que las investigaciones del laboratorio. Trabajar con tripanosomas recién aislados y en la sangre de animales infectados, usando esta técnica, es más pertinente para las diversas investigaciones que estudios con parásitos que han sido cultivadas en condiciones axénicos en el laboratorio durante un período indefinido.
Las relaciones huésped-parásito se estudian mejor con un parásito que infecta a su huésped natural, por lo tanto, T. musculi, un parásito murino natural, que es representante de tripanosomas extracelulares, tiene muchas ventajas como infección murine consiste en un animal de laboratorio pequeño y no requiere condiciones de nivel (BSL) de seguridad de sustancias biopeligrosas. T. musculi no mata a los ratones inmunocompetentes, a diferencia de muchas otras especies de Trypanosoma , incluyendo patógenos humanos. T. musculi no se eliminan en los ratones desprovistos de la célula de T y parasitemias puede ser aumentada en los ratones infectados mediante la modificación de la ingesta de alimentos y nutrientes11. Este parásito modula la respuesta inmune en coinfección con otros patógenos12. T. musculi de ratones infectados exhiben diferencias de cultivo T. musculi, por ejemplo, la expresión de receptores de Fc de la membrana se pierde en cultivos axénicos T. musculi , comparados con parásitos purificados de ratones infectados13 , 14. factores Excreted secretada (FSE) son también cualitativamente y cuantitativamente menos expresada en cultivos axénicos Tripanosoma y difieren entre las cepas aisladas en áreas endémicas15. FSE son los antígenos primera muestra al sistema inmune anfitrión y así juegan un papel importante en la acogida inicial de la respuesta inmune16.
En animales infectados experimentalmente para las investigaciones del laboratorio, este protocolo facilita la experimentación con un mayor número de parásitos, reduciendo al mínimo el número de ratones requerida especialmente cuando se utilizan animales inmunosuprimidos. Las glicoproteínas de superficie variables (VSGs) que se utilizan en la prueba de aglutinación de tarjeta para tripanosomiasis (CATT) en la detección de masas todavía son purificadas de tripanosomas que se propagan en ratas. Las dos pruebas de diagnóstico rápido (cassettes individualmente) que ahora están disponibles para su uso en el campo, siguen utilizando una fuente infecciosa modelo nativa VSGs y no en vitro cultivados tripanosomas1,4, 5. el avance en el estudio de tripanosoma Inmunología y la biología se ha facilitado ya que estos parásitos DEAE celulosa purificada pueden obtenerse fácilmente en grandes cantidades de hosts infectados natural o experimentalmente y en particulares, roedores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tripanosomas purificadas representan un medio poderoso para estudiar Inmunología, bioquímica, biología celular y molecular. Grandes extensiones de datos y resultados se han obtenido de tripanosomas, que luego ha ayudado a obtener información de otras células eucariotas30. Tripanosomas son también el tema de investigación importante e interesante porque han ideado numerosos mecanismos que les permiten sobrevivir y crecer en dos ambientes muy diferentes: el vector de la mosca tsetsé y el del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros de la UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta investigación fue apoyada por el financiamiento interno de la Universidad de Burdeos y el apoyo de la ANR, la empresa LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 y de la Asociación pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale y el servicio de Service de Coopération et d ‘ action culturelle de l ‘ Ambassade de France à Bangui (Centroafricana).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
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