Визуализировать дрозофилы ноги мотонейрона аксоны через взрослых кутикулы
Summary
Здесь мы описываем протокол для визуализации аксональное ориентации с флуоресцентными белка в взрослых ноги дрозофилы , фиксации, монтаж, обработка изображений и шаги пост изображений.
Abstract
Большая часть работы по нейрональных спецификации были проведены в генетически и физиологически шансов справиться с возникающими моделей, таких как C. Элеганс, дрозофилы личинок и рыбы, которые занимаются волнообразно движений (как обход или плавание) как их основной режим локомоции. Однако, более сложный понимание спецификации индивидуального двигательного нейрона (MN) — по крайней мере с точки зрения информирования терапии болезни — требует столь же шансов справиться с возникающими системы, которая лучше моделирует комплекс на базе придаток локомоции схемы позвоночных животных. Взрослых дрозофилы опорно-двигательного аппарата отвечает за ходьба отвечает всем из этих критериев с легкостью, поскольку в этой модели это можно изучить спецификации небольшое количество легко отличить ноги MNs (примерно 50 MNs на ноги) как с использованием обширной массив из мощных инструментов генетических и в контексте физиологические системы на основе придаток локомоции. Здесь мы описываем протокол для визуализации иннервации мышц ног в взрослых летать.
Introduction
Как позвоночных конечности дрозофилы взрослых ноги делится на сегменты. Каждый полет нога содержит 14 мышцы, каждая из которых включает в себя несколько мышечных волокон1,2. Клетки тела взрослых ноги MNs расположены в Т1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 и T3 (metathoracic) ганглиев на каждой стороне воспалении брюшины шнура (VNC), структурный аналог позвоночных спинного мозга (рис. 1). Есть примерно 50 MNs в каждом ганглии, какие целевые мышцы в четырех сегментах ипсилатеральной ноге (coxa, вертела, бедра и голени) (рис. 1)3. Важно отметить, что каждый индивидуальный Взрослый ноги MN имеет уникальный морфологической идентификации, который весьма стереотипно между животных3,4. Все эти уникальные MNs являются производными от 11 стволовых клеток, называемых нейробласты (НБС) производства ногу MNs в личиночной стадии3,4. В конце все личиночной стадии незрелых Постмитотические MNs дифференцировать во время метаморфозы приобретать их конкретных дендритных беседки и аксональной терминала цели, которые определяют их уникальной морфологии3,4. Ранее мы тестировали гипотеза, комбинаторные код транскрипционных факторов (TFs) определяет уникальный морфология каждой дрозофилы ноги MN5взрослых. Как модель мы использовали линии B, один из 11 линий NB, которые производит семь из МНБ и продемонстрировал, что комбинаторной кода TFs, выраженные в Постмитотические взрослых ногу MNs диктует свои индивидуальные морфологии. Reprograming код TF МНБ мы были в состоянии переключиться MN морфологии на предсказуемой основе. Мы называем эти TFs: mTFs (морфологические TFs)5.
Одна из самых сложных частей морфологического анализа взрослых MNs является визуализировать аксоны через толстые и авто люминесцентные кутикулы с высоким разрешением. Мы обычно ярлык аксоны с меткой мембраны GFP, что выражается в MNs с системой двоичного выражения, такие как DVglut-Gal4/бла mCD8::GFP или DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, где DVglut — это сильное драйвер, выраженных в 6мотонейронов. Объединив эти инструменты с другими клоновых методы, как анализ мозаика с repressible маркер (MARCM)7,8стран СНГ MARCM или MARCMbow5, мы можем ограничить экспрессия гена GFP в субпопуляции МНБ фенотипического анализа аксонов проще. Мы породили протокол для того, чтобы держать ноги MN аксональное морфология нетронутыми для изображений и последующих 3D-реконструкции путем решения конкретных проблем, присущих взрослых дрозофилы ноги как (1) фиксация внутренних структур взрослых ноги не затрагивая аксона морфологии, эндогенного флуоресцентные выражение и мускулатура ноги, (2) монтаж ноги, чтобы сохранить общую структуру под coverslip и соответствующей ориентации для обработки для получения кутикулы изображений изображений и (3) фон, а также аксональное флуоресцентного сигнала. Хотя этот протокол был подробно для обнаружения флуоресцентные выражения в MN аксонов, он может применяться для визуализации другие компоненты ноги neuromusculature в членистоногих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кутикула взрослых дрозофилы и других членистоногих, который содержит много темные пигменты, является основным препятствием для просмотра структуры внутри своего тела. Кроме того это сильно авто люминесцентная, которая усугубляется фиксации. Эти две функции являются весьма проблемат?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Роберт Ренар для подготовки среднего покупать продукты питания. Эта работа было поддержано NIH Грант NS070644 R.S.M. и финансирования от ALS ассоциация (#256), FRM (#AJE20170537445) и программа ATIP-Avenir ю.е.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
