تصور المورفولوجية الساق الحركية محاور عصبية من خلال بشرة الكبار
Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور استهداف محواري مع بروتين الفلورسنت في الساقين الكبار من المورفولوجية التثبيت والمتصاعدة، والتصوير، والتصوير بعد انتهاء الخطوات.
Abstract
نفذت معظم العمل لمواصفات الخلايا العصبية في نماذج أصعب وراثيا وفسيولوجيا مثل ج. ايليجانس، اليرقات المورفولوجية ، والأسماك، والتي جميعها الانخراط في حركات أوندولاتوري (مثل الزحف أو السباحة) كطريقة أساسية للحركة. ولكن أكثر تطورا فهم المواصفات الفردية الخلايا العصبية الحركية (مينيسوتا) – على الأقل فيما يتعلق بإبلاغ علاجات الأمراض – يطالب نظام يستهدف أيضا أفضل نماذج مخططات الحركة المعقدة القائمة على أطرافهم الفقاريات. النظام الحركي المورفولوجية الكبار المسؤولين عن المشي تلبي جميع هذه المعايير بسهولة، في هذا النموذج أنه من الممكن لدراسة مواصفات عدد صغير من الساق تمييزها بسهولة MNs (حوالي 50 MNs كل جولة) كلا استخدام واسعة مجموعة من الأدوات الوراثية قوية، وفي سياق الفسيولوجية لوضع خطة تحرك تستند إلى طرف من أطرافهم. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور تعصيب عضلة الساق في يطير الكبار.
Introduction
مثل الفقاريات أطرافهم، وساقه الكبار المورفولوجية ينقسم إلى شرائح. ويتضمن كل ساق يطير عضلات 14، كل منها يضم عدة ألياف العضلات1،2. تقع جثث خلية MNs الساق الكبار في T1 (بروثوراسيك)، T2 (ميسوثوراسيك)، والعقد T3 (ميتاثوراسيك) على كل جانب من الحبل البطني العصب (فنك)، هيكلي مشابه للحبل الشوكي الفقاريات (الشكل 1). وهناك ما يقرب من 50 MNs في كل العقد، التي تستهدف عضلات في أربعة أجزاء من الساق عن (كوكسا، تروتشانتير، وعظم الفخذ، والساق) (الشكل 1)3. الأهم من ذلك، يحتوي كل ساق الكبار الفردية MN هوية فريدة من نوعها مورفولوجية التي هي النمطية للغاية بين الحيوانات3،4. كل هذه MNs فريدة مستمدة من 11 من الخلايا الجذعية، يسمى نيوروبلاستس (مكتب الإحصاء الوطني) المنتجة للمحطة MNs خلال مراحل اليرقات3،4. في نهاية كل مراحل اليرقات تفرق MNs بوستميتوتيك غير ناضجة أثناء التحول للحصول على العرش الجذعية محددة وأهداف المحطة الطرفية محواري التي تعرف بهم مورفولوجيا فريدة من نوعها3،4. سابقا قمنا باختبار الفرضية القائلة بأن مدونة اندماجي لعوامل النسخ (TFs) تعين مورفولوجية فريدة من نوعها لكل ساق المورفولوجية الكبار MN5. كنموذج، قمنا باستخدام النسب ب أحد الأنساب NB 11 التي تنتج سبعة من أصل MNs وأثبتت أن مدونة اندماجي TFs المعرب عنها في الساق الكبار بوستميتوتيك MNs يملي على مورفولوجيس الفردية. قبل ريبروجرامينج مدونة TF MNs قد تمكنا من تبديل MN مورفولوجيس بطريقة يمكن التنبؤ بها. ونحن ندعو هذه TFs: mTFs (TFs المورفولوجية)5.
واحدة من أصعب الأجزاء من التحليلات المورفولوجية للكبار MNs تصور محاور عصبية عن طريق بشرة سميكة والسيارات-فلوري بدقة عالية. نحن عادة ما تسمية محاور عصبية مع معلم غشاء بروتينات فلورية خضراء التي يتم التعبير عنها في MNs مع نظام ثنائي تعبير، مثل دفجلوت-Gal4/UAS-mCD8::GFP أو دفجلوت-QF/QUAS mCD8::GFP، حيث دفجلوت تشكل دافعا قويا في 6من موتونيورونس. من خلال الجمع بين هذه الأدوات مع تقنيات الاستنساخ الأخرى مثل تحليل فسيفساء بعلامة ريبريسيبلي (ماركم)7، ورابطة الدول المستقلة-ماركم8أو ماركمبوو5، نحن يمكن تقييد التعبير التجارة والنقل للفئات السكانية الفرعية لإجراء تحليل المظهرية MNs من محاور عصبية أسهل. ونحن قد ولدت بروتوكول بغية إبقاء الساق مورفولوجيا محواري MN سليمة للتعمير 3D التصوير واللاحقة بمعالجة مسائل معينة مضمنة في الساق المورفولوجية الكبار مثل التثبيت (1) بشأن الهياكل الداخلية لفريق الخبراء البالغين دون التأثير على مورفولوجيا إكسون والتعبير الفلورسنت الذاتية، وعضلات الساق، (2) تركيب المحطة للمحافظة على الهيكل العام لإطار ساترة وفي الاتجاه المناسب للتصوير، و (3) معالجة للحصول على بشرة الصور الخلفية، فضلا عن إشارة الفلورسنت محواري. بينما هذا البروتوكول تفصيلي للكشف عن التعبير الفلورسنت في مينيسوتا محاور عصبية، أنه يمكن تطبيقها على تصور مكونات أخرى من الساق نيوروموسكولاتوري في المفصليات.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشرة المورفولوجية الكبار والمفصليات الأخرى، التي تحتوي على العديد من الصبغات الداكنة، يشكل عقبة رئيسية لعرض هياكل داخل أجسامهم. وبالإضافة إلى ذلك، أنها بشدة الفلورسنت السيارات التي تتفاقم بالتثبيت. هاتان السمتان إشكالية جداً بالنسبة للملاحظات من الأصباغ الفلورية أو الجزيئات داخل الجس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر رينار روبرت لإعداد الطعام ذبابة المتوسط. وكان هذا العمل مدعومة بمنحه المعاهد الوطنية للصحة NS070644 R.S.M. والتمويل من رابطة ALS (رقم 256) والعلاجات (#AJE20170537445) والبرنامج افينير ATIP على J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
