Kültür ve manipülasyon O9-1 nöral Crest hücre
Summary
O9-1 multipotent fare nöral crest hücre çizgidir. Burada O9-1 hücre kültürü çalışmalarının, O9-1 hücreleri belirli hücre türleri ayırt ve genetik olarak siRNA aracılı nakavt veya CRISPR-Cas9 genom düzenleme kullanarak O9-1 hücreleri manipüle ayrıntılı adım adım iletişim kuralları açıklar.
Abstract
Nöral crest hücreleri (NCCs) da farklı hücre türleri ayırt birden fazla doku ve organların ortaya çıkmasına multipotent kök hücreleri geçiş vardır. O9-1 hücre kültürünü endojen türetilmiştir embriyonik NCCs fare ve onun multipotency korur. Ancak, belirli koşullarda O9-1 hücreler farklı hücre türleri ayırt edebilir ve araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılmak. Son zamanlarda, fare çalışmaları ve O9-1 hücre çalışmaları kombinasyonu ile biz yolu effectors Yap ve Taz nöral crest kaynaklı kraniyofasiyal gelişiminde önemli rol oynarlar sinyal Hippo göstermiştir. O9-1 hücreler için kodlamayla işlem diğer hücre hatlarında kullanılan daha karmaşık olmakla birlikte, O9-1 hücre kültürünü NCCs içinde vitroaraştırılması için güçlü bir modeldir. Burada, farklı hücre tipleri, düz kas hücreleri ve dokusunu gibi içine O9-1 hücreleri differentiating için protokol yanı sıra kendi stemness korumak için O9-1 hücre kültürünü kültür için bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, iletişim kuralları CRISPR-Cas9 silme ve küçük müdahale RNA-aracılı nakavt kullanarak O9-1 hücrelerde gen fonksiyon kaybı çalışmaları gerçekleştirmek için açıklanmıştır.
Introduction
Nöral crest hücrelerdir (NCCs) multipotent gibi kök hücreleri bir göçmen görmeyeteneği ve embriyonik gelişim sırasında geçici varlığı. NCCs yüzey ektoderm ve nöral tüp arasında köken ve embriyo diğer bölümlerine embriyonik geliştirme1sırasında geçiş. İşlevsel etki alanları üzerinde bağlı olarak, NCCs birkaç kafatası dahil olmak üzere farklı türleri, gövde, vagus, sakral ve kardiyak NCCs sınıflandırılabilir. Buna ek olarak, NCCs düz kas hücreleri, kemik hücreleri ve nöronlar, gibi birden çok hücre soy içine ayırt etmek ve çeşitli dokularda2,3‘ e neden olmaktadır. NCCs gelişimi çeşitli moleküler sinyalleri tarafından ince ayar morfogenetik olaylar karmaşık bir dizi ile karakterizedir. NCCs karmaşık düzenlenmesi ve çok sayıda yapıları onların önemli katkıları göz önüne alındığında, NCC geliştirme bozukluk yaygın konjenital Doğum kusurları, tüm insan konjenital Doğum kusurları yaklaşık % 30 için hangi hesabı açabilir. Anormallikler nöral kret geliştirme sırasında yarık dudak/kusurlu damak için neden olabilir burun oluşumu, sendromlar, kusurları bir arızalı kardiyak çıkış yolu veya bile bebek ölüm1,4,5, gibi 6 , 7. moleküler mekanizmaları NCC gelişiminin en önemli kusurları NCC geliştirme neden olduğu hastalıklar için tedavi geliştirmek için önemli noktadır. 8,9,10,11,12,13,14 çeşitli vitro ve in vivo kullanılarak yaklaşımlar ,15, önemli ilerleme NCC araştırma yapılmıştır. Vivo, tavuk, amfibiler, zebra balığı ve fareler, hayvan modeller NCCs1araştırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, ilk insan embriyo gelişimi16NCC geçiş sürecinin çalışmaya insan embriyosu kullanılmıştır. Vitro, hücre modelleri hasta subkutan yağ, kökenli insan NCCs gibi NCCs için Parkinson hastalığı17araştırmak için kullanılmıştır. Aslında endojen NCCs E8.5 fare embriyo18izole kitle kültürü elde, O9-1 kkk satır okuyan NCCs. önemlisi, Sigara ayırt kültür koşullar altında bir güçlü hücre model, O9-1 hücreler Multipotent kök gibi NCCs. Ancak, değişen kültür şartlar altında O9-1 hücreleri içine ayırt edici hücre tipleri, düz kas hücreleri, dokusunu, kondrosit ve Gliyal hücreler18gibi farklı. Bu özellikler göz önüne alındığında, O9-1 hücreleri moleküler mekanizması kafatası yüz kusurları19,20soruşturma gibi NCC ilgili çalışmaları için genel olarak kullanılmıştır.
Detaylı iletişim kuralları O9-1 hücreleri bakımı, farklı hücre tipleri O9-1 hücreleri ayırt ve gen fonksiyon kaybı çalışmalar CRISPR-Cas9 genom düzenleme ve küçük müdahale RNA (siRNA) ile gerçekleştirerek O9-1 hücreleri manipüle sağlamak burada,- devirme teknolojileri aracılık. Temsil edici bir örnek olarak, Yap ve Taz kaybı–fonksiyonu çalışmaya O9-1 hücreleri kullanımı açıklanmıştır. Yap ve Taz hücre çoğalması, farklılaşma ve Apoptozis kritik bir rol oynamaktadır yolu sinyal Hippo aşağı akım effectors vardır. Hippo yol geliştirme ve homeostasis birkaç farklı doku ve organları, hem de farklı hastalık20,21,22,23 patogenezinde önemli olduğu da gösterilmiştir ,24,25,26,27,28. Hippo sinyal bir çekirdek bileşenleri tümör baskılayıcı steril 20 benzeri kinaz Mst1/2, WW etki alanını içeren Salvador iskele protein ve büyük tümör baskılayıcı homolog (Lats1/2) kinaz içerir. Su aygırı sinyal Yap ve Taz etkinliği engeller ve onların yıkımı sitoplazmada teşvik etmektedir. Hippo üzerinden baskı Yap ve Taz çekirdekleri translocate ve transkripsiyon Co aktivatörler işlev. Biz son zamanlarda gösterdi ki özellikle Wnt1cre kullanarak effectors Yap ve Taz Mouse NCCs sinyal Hippo ihracı ve Wnt1Cre2SOR sürücüleri ile şiddetli E10.5, embriyonik ölümcül sonuçlandı Fasiyal kusurları20. Biz de rolü Yap ve NCCs Taz araştırmaya O9-1 hücreleri kullanarak çalışmaları gerçekleştirdiniz. NCC yayılması ve farklılaşma, Yap ve Taz nakavt yap ve Taz işlevinde çalışmaya hücreleri O9-1 hücrelerde siRNA kullanarak oluşturulan ve Yap nakavt hücreleri CRISPR-Cas9 genom düzenlemeyi kullanarak oluşturulan. Aynı gen fonksiyon kaybı stratejileri farklı hedef genlerin diğer yolları içinde uygulanabilir. Buna ek olarak, işlev kazanç çalışmaları ve transfection deneyleri de gen fonksiyon ve yönetmelik çalışmaya O9-1 hücrelere uygulanabilir. Burada açıklanan protokoller müfettişler tarafından multipotent stemness korumak için O9-1 hücre kültürü çalışmalarının, diğer hücre tipleri farklı kültür koşullar altında içine O9-1 hücreleri differentiating için ve için gen işlev eğitim kılavuzları olarak kullanılmak amacıyla ve NCCs moleküler mekanizmaları.
Protocol
Representative Results
Discussion
NCC sırasında embriyonik morfogenez farklı doku ve organların için çok yönlü ve önemli bir katkıda bulunuyor. O9-1 hücre kültürünü birçok farklı hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel tutar ve NCCs, yapım o gen fonksiyon ve moleküler NCCs Yönetmelikte çalışmak için yararlı vitro aracı vivo içinde özelliklerini taklit eder. O9-1 hücrelerinin farklı durum farklı nöral crest Döl içinde vivo, O9-1 hücre kültürü şartlarına bağlı olarak aynı olmayabili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, Ph.D., ELS, Teksas Kalp Enstitüsü, Bilimsel yayınların editoryal destek sağlamıştır. Biz de aşağıdaki finansman kaynakları teşekkür: Amerikan Kalp Derneği’nin Ulusal Merkezi bilim adamı kalkınma hibe (J. Wang 14SDG19840000), (J. Wang için Rolanette ve Berdon Lawrence kemik hastalığı Texas Program 2014 Lawrence Araştırma Ödülü ) ve Ulusal Sağlık (DE026561 ve DE025873 J. Wang, DE016320 ve DE019650 R. Maxson için) Enstitüleri.
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
