استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1
Summary
O9–1 خط خلية crest العصبي ماوس مولتيبوتينت. هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة لاستزراع خلايا O9–1، والتفريق بين الخلايا O9-1 في أنواع محددة من الخلايا والتلاعب وراثيا O9-1 الخلايا باستخدام siRNA بوساطة ضربة قاضية أو تحرير الجينوم كريسبر-Cas9.
Abstract
وتهاجر الخلايا العصبية كريست (الصافية) الخلايا الجذعية البالغة multipotent التي يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وتؤدي إلى العديد من الأنسجة والأعضاء. خط الخلية O9-1 مشتق من الذاتية الفأر الجنينية البلدان المتبرعة الصافية ويحافظ على مولتيبوتينسي. بيد أن ظروف ثقافة معينة، خلايا O9-1 يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وأن تستخدم في طائفة واسعة من التطبيقات البحثية. في الآونة الأخيرة، مع الجمع بين الدراسات الماوس وخلية O9–1، أننا أظهرنا أن فرس النهر مما يشير إلى مسار المستجيبة ياب وطاز تلعب أدواراً هامة في التنمية الجمجمة المستمدة من قمة العصبية. على الرغم من أن عملية تثقيف للخلايا O9-1 أكثر تعقيداً من التي تستخدم لخطوط الخلايا الأخرى، خط الخلية O9-1 نموذج قوية للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية في المختبر. نقدم هنا، على بروتوكول لاستزراع خط الخلية O9-1 المحافظة على ستيمنيس، فضلا عن البروتوكولات للتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع الخلايا المختلفة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس. وبالإضافة إلى ذلك، يرد وصف بروتوكولات لإجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات في الخلايا O9-1 باستخدام الحذف كريسبر-Cas9 وضربه قاضية بوساطة الرنا التدخل الصغيرة.
Introduction
الخلايا العصبية كريست (الصافية) هي الخلايا الجذعية مثل multipotent مع قدرة المهاجرة رائعة ووجود عابر أثناء التطور الجنيني. البلدان المتبرعة الصافية تنشأ بين الأديم الظاهر السطحي والانبوب العصبي وتهاجر إلى مناطق أخرى للجنين أثناء التطور الجنيني1. استناداً إلى تلك المجالات الوظيفية، ويمكن تصنيف البلدان المتبرعة الصافية إلى عدة أنواع مختلفة، بما في ذلك الجمجمة والجذع، تحفيزه، وعجزي، والقلب البلدان المتبرعة الصافية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن البلدان المتبرعة الصافية تفرق في الأنساب خلية متعددة، مثل خلايا العضلات الملساء، وخلايا العظام، والخلايا العصبية، وتؤدي إلى مختلف الأنسجة2،3. تنمية البلدان المتبرعة الصافية يتسم بسلسلة معقدة من الأحداث مورفوجينيتيك التي يتم ضبطها بالإشارات الجزيئية المختلفة. نظراً لتنظيم معقد من البلدان المتبرعة الصافية ومساهماتها الهامة لهياكل عديدة، يمكن أن تؤدي التقلبات التنمية NCC عادة إلى العيوب الخلقية عند الولادة، التي تمثل ما يقرب من 30 في المائة من جميع العيوب الخلقية الخلقية البشرية. تشوهات أثناء تطوير crest العصبي يمكن أن يؤدي إلى شق الشفة/الحنك، معيبة بعيوب تشكيل الآنف، المتلازمات، مثل تدفق القلب المعيبة المسالك أو وفيات الرضع حتى1،،من45، 6 , 7-فهم الآليات الجزيئية للتنمية NCC مهم لتطوير علاجات للأمراض الناجمة عن عيوب في تنمية البلدان المتبرعة الصافية. مع استخدام مختلف في المختبر و في فيفو النهج8،،من910،11،،من1213،14 15من ،، وقد تم إحراز تقدم كبير في لجنة التنسيق الوطنية للبحث. في فيفو، نماذج حيوانية، بما في ذلك الدواجن والبرمائيات، الزرد، والفئران، قد استخدمت للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية1. وعلاوة على ذلك، استخدمت الأجنة البشرية لدراسة عملية الهجرة الصافية في التنمية الجنين البشري المبكر16. في المختبر، نماذج الخلية للبلدان المتبرعة الصافية، مثل البلدان المتبرعة الصافية البشرية التي نشأت من الدهون تحت الجلد المريض، قد استخدمت للتحقيق في مرض باركنسون17. الخط NCC O9–1، والتي استمدت أصلاً من الثقافات الجماعية من البلدان المتبرعة الصافية الذاتية معزولة عن E8.5 الماوس الأجنة18، نموذج خلية قوية لدراسة البلدان المتبرعة الصافية. الأهم من ذلك، تحت ظروف ثقافة عدم التمييز، وخلايا O9-1 مولتيبوتينت الشبيهة الجذعية البلدان المتبرعة الصافية. ومع ذلك، تحت ظروف الثقافة المختلفة، الخلايا O9-1 يمكن أن تكون متباينة في أنواع الخلايا المتميزة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس، تشوندروسيتيس، والخلايا الدبقية18. ونظرا لهذه الخصائص، خلايا O9-1 على نطاق واسع استخدمت الدراسات المتصلة بالبلدان المتبرعة الصافية، مثل التحقيق في الآلية الجزيئية لعيوب الجمجمة الوجه19،20.
وترد هنا، بروتوكولات مفصلة للحفاظ على الخلايا O9-1 والتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع مختلفة من الخلايا، والتلاعب الخلايا O9-1 عن طريق إجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات مع تحرير الجينوم كريسبر-Cas9 والحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)- بوساطة تقنيات ضربة قاضية. وكمثال ممثل، هو وصف استخدام الخلايا O9-1 دراسة ياب و طاز الخسارة-من-وظيفة. ياب وطاز هي المصب المستجيبة لفرس النهر مما يشير إلى المسار، الذي يلعب دوراً حاسما في انتشار الخلايا، والتمايز، والمبرمج. كما تبين في مسار فرس النهر لتكون هامة في التنمية والتوازن عدة من مختلف الأنسجة والأعضاء، وكذلك في الآلية المرضية لأمراض مختلفة20،،من2122،23 ،،من2425،26،،من2728. تتضمن العناصر الأساسية لفرس النهر مما يشير إلى مؤنزم 20-مثل العقيمة ورم القامع Mst1/2 وبروتين سقالة السلفادور التي تحتوي على المجال WW مؤنزم homolog (Lats1/2) القامع الورم كبير. فرس النهر مما يشير إلى يحول دون نشاط ياب وطاز، وتروج عن التدهور في السيتوبلازم. دون القمع من فرس النهر، يمكن أن ترانسلوكاتي إلى نويات ياب وطاز وتعمل كوسائل تفعيل المشارك النسخي. ونحن مؤخرا أظهرت أن يخمد تحديداً فرس النهر إشارات المستجيبة ياب وطاز في الماوس البلدان المتبرعة الصافية باستخدام Wnt1لجنة المساواة العرقية والسائقين Wnt1Cre2SOR أسفرت عن الفتك الجنينية في E10.5 مع شديد 20من عيوب الجمجمة. ونحن أيضا بإجراء دراسات باستخدام خلايا O9-1 للتحقيق في دور ياب وطاز في البلدان المتبرعة الصافية. دراسة دالة ياب وطاز في انتشار NCC والتمايز و ياب وضربه قاضية طاز خلايا تم إنشاؤها في الخلايا O9-1 باستخدام siRNA، وخلايا خروج المغلوب ياب تم إنشاؤها بواسطة استخدام تحرير الجينوم كريسبر-Cas9. يمكن تطبيق نفس الاستراتيجيات فقدان لوظيفة الجينات على الجينات المستهدفة المختلفة في مسارات أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق مكسب للدالة دراسات وفحوصات تعداء الخلايا O9-1 لدراسة وظيفة الجينات والتنظيم. البروتوكولات المذكورة هنا تهدف إلى استخدام المحققين كأدلة لاستزراع خلايا O9-1 المحافظة على ستيمنيس مولتيبوتينت، لتمييز الخلايا O9-1 إلى أنواع أخرى من الخلايا تحت ظروف مختلفة من الثقافة، ودراسة وظيفة الجينات و الآليات الجزيئية للبلدان المتبرعة الصافية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لجنة التنسيق الوطنية أحد مساهمين الرئيسيين وتنوعاً لمختلف الأنسجة والأعضاء خلال morphogenesis الجنينية. خط الخلية O9-1 يحافظ على قدرته على التفريق في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ويحاكي في فيفو خصائص البلدان المتبرعة الصافية، يجعلها أداة مفيدة في المختبر لدراسة وظيفة الجينات والت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نيكول ستانسل، دكتوراه، ELS، المنشورات العلمية في معهد القلب تكساس، تقدم الدعم التحريري. ونشكر أيضا مصادر التمويل التالية: “منحة تطوير عالم مركز جمعية القلب الأمريكية الوطنية” (14SDG19840000 إلى وانغ ياء)، “جائزة البحوث لورانس” 2014 من رولانت وبيردون لورانس العظام المرض البرنامج من تكساس (إلى وانغ جيه )، والمعاهد الوطنية للصحة (DE026561 و DE025873 إلى وانغ جي، DE016320، و DE019650 إلى ماكسسون ر.).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
