La coltura e la manipolazione di cellule della cresta neurale O9-1
Summary
O9-1 è una linea di cellule neurali della cresta multipotenti del mouse. Qui descriviamo protocolli dettagliati passo-passo per la coltura delle cellule O9-1, O9-1 cellule differenziate in tipi cellulari specifici e manipolando geneticamente O9-1 cellule utilizzando siRNA-mediata atterramento o CRISPR-Cas9 editing genomico.
Abstract
Cellule della cresta neurale (NCCs) esegue la migrazione di cellule staminali multipotenti che possono differenziarsi in diversi tipi cellulari e dar luogo a più organi e tessuti. La linea cellulare O9-1 è derivata dall’endogeno del mouse NCCs embrionali e mantiene la sua multipotenza. Tuttavia, in condizioni di impostazioni cultura specifiche, O9-1 cellule possono differenziarsi in diversi tipi cellulari ed essere utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca. Recentemente, con la combinazione di studi del topo e gli studi di O9-1 delle cellule, abbiamo dimostrato che l’ippopotamo effettori della via di segnalazione Yap e Taz svolgono i ruoli importanti nello sviluppo craniofacial di derivazione dalla cresta neurale. Anche se il processo coltivante per cellule O9-1 è più complicato rispetto a quella utilizzata per altre linee cellulari, la linea cellulare O9-1 è un potente modello per indagare NCCs in vitro. Qui, presentiamo un protocollo per la coltura la linea cellulare O9-1 per mantenere la sua staminalità, così come protocolli per la differenziazione di cellule O9-1 in tipi differenti delle cellule, quali cellule muscolari lisce e osteoblasti. Inoltre, vengono descritti protocolli per l’esecuzione di studi di perdita di funzione del gene in cellule O9-1 utilizzando CRISPR-Cas9 eliminazione e piccola interferenza RNA-mediata atterramento.
Introduction
Cellule della cresta neurale (NCCs) sono cellule simil-staminali multipotenti con una notevole capacità migratorie ed esistenza transitoria durante lo sviluppo embrionale. NCCs provengono tra l’ectoderma superficiale e il tubo neurale e migra in altre parti dell’embrione durante lo sviluppo embrionale1. Basato sui loro domini funzionali, CNC possono essere classificati in vari tipi, tra cui cranica, tronco, vagale, sacra e NCCs cardiaco. Inoltre, NCCs possono differenziarsi in stirpi multipli delle cellule, quali cellule muscolari lisce, cellule ossee e neuroni e dar luogo a vari tessuti2,3. Lo sviluppo di CNC è caratterizzato da una serie complessa di eventi morfogenetici che sono messo a punto da vari segnali molecolari. Data la complessa regolazione del CNC e loro importanti contributi di numerose strutture, l’alterazione dello sviluppo di NCC può portare comunemente ai difetti di nascita congeniti, che rappresentano quasi il 30% di tutti i difetti di nascita umani congeniti. Anomalie durante lo sviluppo neurale della cresta possono portare a labio/palatoschisi, imperfetta formazione di naso, sindromi, difetti come un tratto di efflusso cardiaco difettoso, o mortalità infantile anche1,4,5, 6 , 7. la comprensione dei meccanismi molecolari dello sviluppo di NCC è importante per lo sviluppo di trattamenti per malattie causate da difetti nello sviluppo di NCC. Con l’uso di vari in vitro e in vivo si avvicina8,9,10,11,12,13,14 ,15, notevoli progressi compiuti nella ricerca di NCC. In vivo, modelli animali, compresi polli, anfibi, zebrafish e topi, sono stati utilizzati per indagare NCCs1. Inoltre, gli embrioni umani sono stati utilizzati per studiare il processo di migrazione di NCC in iniziali di sviluppo dell’embrione umano16. In vitro, modelli cellulari per CNC, come NCCs umana che ha originato dal paziente grasso sottocutaneo, sono stati utilizzati per studiare la malattia del Parkinson17. La linea NCC O9-1, che originalmente è stata derivata dalle colture di massa di endogeno NCCs isolato dal E8.5 del mouse embrioni18, è un modello di cellulare potente per studiare NCCs. soprattutto, in condizioni di coltura non-differenziante, cellule O9-1 sono NCCs simil-staminali multipotenti. Tuttavia, in diverse condizioni di coltura, le cellule O9-1 possono essere differenziate in tipi distinti delle cellule, quali cellule di muscolo liscio, osteoblasti, condrociti e di cellule gliali18. Date queste caratteristiche, cellule O9-1 sono stati largamente utilizzate per studi di NCC-correlati, quali indagare il meccanismo molecolare di difetti cranio-facciali19,20.
Qui, protocolli dettagliati sono forniti per mantenimento O9-1 delle cellule, differenziazione cellule O9-1 in diversi tipi cellulari e manipolare cellule O9-1 eseguendo studi di perdita di funzione del gene con CRISPR-Cas9 editing genomico e piccolo RNA interferente (siRNA)- mediate tecnologie atterramento. Come un esempio rappresentativo, l’uso delle cellule O9-1 per studiare Yap e Taz perdita di funzione è descritto. Yap e Taz sono gli effettori a valle del Hippo segnalazione via, che svolge un ruolo critico nella proliferazione cellulare, differenziamento e apoptosi. Il pathway di Hippo ha anche dimostrato di essere importante nello sviluppo e nell’omeostasi di parecchi diversi tessuti e organi, così come nella patogenesi di diverse malattie20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. I componenti principali di Hippo segnalazione includono la chinasi 20-like sterile di tumore soppressore Mst1/2, proteina impalcatura WW dominio contenenti Salvador e le chinasi di grande tumore soppressore dell’omologo (Lats1/2). Ippopotamo di segnalazione inibisce l’attività di Yap e Taz e promuove la loro degradazione nel citoplasma. Senza repressione da ippopotamo, Yap Taz traslocano in nuclei e può funzionare come co-attivatori trascrizionali. Recentemente abbiamo dimostrato che in particolare inattivando l’ippopotamo segnalazione effettori Yap e Taz nel topo NCCs utilizzando il Wnt1cre e Wnt1Cre2SOR driver ha provocato la mortalità embrionale alle e 10.5 con grave i difetti craniofacial20. Abbiamo anche effettuato studi usando le cellule O9-1 per studiare il ruolo di Yap e Taz in CNC. Per studiare la funzione Yap e Taz in NCC proliferazione e differenziazione, Yap e Taz atterramento cellule sono state generate in cellule O9-1 utilizzando siRNA e Yap knockout cellule sono state generate utilizzando CRISPR-Cas9 editing genomico. Le stesse strategie di perdita-de-funzione del gene possono essere applicate a geni bersaglio diversi in altre vie. Inoltre, guadagno di funzione studi e saggi di transfezione possono anche applicarsi alle cellule O9-1 per studiare la regolazione e la funzione del gene. I protocolli descritti qui sono destinati ad essere utilizzati dagli investigatori come guide per la coltura di cellule O9-1 per mantenere la staminalità multipotenti, per differenziare le cellule O9-1 in altri tipi cellulari sotto differenti condizioni di coltura e per lo studio della funzione genica e i meccanismi molecolari di CNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il servizio NCC è un versatile e chiave collaboratore di diversi tessuti e organi durante la morfogenesi embrionale. La linea cellulare O9-1 mantiene la sua capacità di differenziarsi in molti tipi differenti delle cellule e imita le caratteristiche in vivo di CNC, rendendolo uno strumento utile in vitro per lo studio della funzione del gene e regolazione molecolare in CNC. La condizione differente delle cellule O9-1 può corrispondere a diversi dalla cresta neurale progenie in vivo, a second…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, pH.d., ELS, di pubblicazioni scientifiche presso il Texas Heart Institute, ha fornito supporto editoriale. Ringraziamo anche le seguenti fonti di finanziamento: National Center scienziato Development Grant dell’American Heart Association (14SDG19840000 a J. Wang), il premio di ricerca di Lawrence 2014 dal Rolanette e Berdon Lawrence osso malattia programma del Texas (a Wang J. ) e il National Institutes of Health (DE026561 e DE025873 J. Wang, DE016320 e DE019650 di Maxson R.).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
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