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Bioengineering

Rígida fijación de fijo y manchados, todo, escala milimétrica muestras para histología sin sección 3D de tomografía Micro computada

Published: October 17, 2018
doi:
10.3791/58293
, , , , , , , , ,
1The Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research,Penn State College of Medicine, 2Division of Experimental Pathology, Department of Pathology,Penn State College of Medicine, 3Medical Scientist Training Program,Penn State College of Medicine, 4Center for In Vivo Microscopy,Duke University Medical Center, 5KTM Research

Summary

Desarrollado protocolos y diseñó un aparato personalizado para permitir la inclusión de especímenes de escala milimétrica. Se presentan procedimientos de preparación de la muestra con un énfasis en la inclusión en resina de acrílico y poliamida tubo para lograr la inmovilización rígida y almacenamiento a largo plazo de las muestras para el interrogatorio de la morfología de arquitectura y de la célula de tejido micro-CT.

Abstract

Por más de cien años, el estudio histológico de los tejidos ha sido el estándar de oro para el diagnóstico médico ya que la histología permite a todos los tipos de células en cada tejido para ser identificado y caracterizado. Nuestro laboratorio está trabajando activamente para hacer avances en rayos x micro-tomografía computada (micro-CT) que traerá el poder diagnóstico de la histología para el estudio de los volúmenes de tejido completo en celulares de resolución (es decir., una radiografía Modalidad de histo-Tomography). Con este fin, hemos realizado mejoras dirigidas a la canalización de preparación de muestra. Una optimización clave y el enfoque del presente trabajo, es un método sencillo para incrustar rígido de muestras fijas y teñidas a escala de milímetro. Muchos de los métodos publicados para inmovilización de la muestra y proyección de imagen correlativa de micro-CT confían en colocar las muestras en parafina, agarosa o líquidos como el alcohol. Nuestro enfoque extiende este trabajo con procedimientos personalizados y el diseño de un aparato para imprimir 3 dimensiones incrustar las muestras en una resina acrílica directamente en polyimide de la tubería, que es relativamente transparente a los rayos x. Procedimientos de preparación de la muestra son descritos para las muestras de 0,5 a 10 mm de diámetro, que sería adecuado para las larvas de pez cebra entera y menores de edad u otros animales y muestras de tejidos de similares dimensiones. Como prueba de concepto, hemos integrado a los especimenes de Danio, Drosophila, Daphniay un embrión de ratón; se muestran imágenes representativas de las exploraciones de 3 dimensiones para tres de estas muestras. Lo importante, nuestra metodología conduce a múltiples beneficios, incluyendo la inmovilización rígida, preservación a largo plazo de recursos laboriosamente creado y la capacidad para volver a interrogar las muestras.

Introduction

Los fenotipos son características observables de un organismo que representan las consecuencias de la interacción única entre su fondo genético y el medio ambiente. Estas características pueden incluir propiedades conductuales, bioquímicos, morfológicos, desarrollo o fisiológicas. Importante, las diferencias en características entre los organismos de tipo silvestre y mutantes genéticos pueden proporcionar información clave sobre los mecanismos y funciones de los genes afectados. Con respecto a la morfología, la histopatología es el gold standard para la evaluación de fenotipos a nivel celular pero sufre de artefactos mecánicos y no permite análisis volumétrico cuantitativo1. Nuestro laboratorio está motivado para superar los obstáculos a la aplicación del diagnóstico poder de histología a los volúmenes de tejido completo en la resolución del submicron.

Una encuesta de las tecnologías disponibles sugiere que la proyección de imagen por rayos x micro-computarizada tomografía (micro-CT) puede proporcionar capacidades ideal para escala milimétrica todo animal 3 dimensiones (3D) la histología. Micro-CT permite la visualización no destructiva, isotrópico, 3D y la capacidad para realizar análisis cuantitativo de tejido arquitectura1,2. En los últimos años, la proyección de imagen 3D del pez cebra sin manchas y manchados de metal por micro-CT ha ganado cada vez mayor tracción y ha sido utilizada para el análisis volumétrico de varios tejidos, incluyendo músculo, dientes, hueso y tejido adiposo3,4 ,5,6,7,8,9,10. Otros organismos modelo y muestras de tejido son también susceptibles de micro-CT en la proyección de imagen. Por ejemplo, una tubería se ha introducido para la cuantificación de mesoescala denso Neuroanatomía del cerebro de ratón reflejada mediante sincrotrón micro-CT11. Asimismo, un protocolo de tinción eosina-basado ha demostrado ser adecuado para la proyección de imagen de micro-CT en tejidos blandos de todo ratón órganos12. Análisis morfométrico de las vértebras humanas sin manchas de L3 y la visualización de plata-manchados los pulmones mediante micro-CT han demostrado la utilidad de esta tecnología para humanos muestras13,14.

Para actualizar la gran promesa de micro-CT para fenotipado morfológico completa de pequeños animales intactos y muestras de tejido, una serie de obstáculos que superar en lo referente a rendimiento, resolución, campo de visión, amplia célula tinción, y la preservación a largo plazo. Mientras que cada uno de estos aspectos es de vital importancia, el enfoque del presente manuscrito es la optimización de los procedimientos de inclusión, con notas adicionales muestra fijación y tinción. Coloración de metales pesados es útil porque el contraste inherente entre diferentes tejidos suaves en las imágenes micro-CT es bajo. La potencia de metal varias manchas, como el tetróxido de osmio, yodo, ácido fosfotúngstico (PTA) y gallocyanin-chromalum mejorar el contraste para la proyección de imagen micro-CT ha sido estudiado15,16,17. Acetato de uranilo también se ha utilizado como un agente de contraste para la proyección de imagen micro-CT de hueso y cartílago18,19. PTA como en nuestro protocolo conduce a coloración constante de casi todos los tejidos y las células en especímenes de pez cebra entera, produciendo imágenes son potencialmente compatibles con estudios de histología-como a través de volúmenes completos del tejido.

Durante la adquisición de imágenes micro-CT, proyección 2 dimensiones (2D) se toma como la muestra es rotada por una fracción de un grado y repite hasta que la muestra ha completado una rotación de 180° o 360°, generando una serie de miles de proyecciones 2D utilizadas para la reconstrucción del volumen 3D20. En este proceso, cualquier perturbación de la muestra hará las correspondientes proyecciones 2D que fuera de la alineación, resultando en volúmenes 3D mal reconstruidos. Inmovilización de la muestra es una forma de corregir este problema y algunas de las estrategias actuales implican sumergir la muestra en alcohol o incrustar en agarosa en tubos de polipropileno o Micropipetas puntas3,5,15, 16 , 21 , 22. métodos de inmersión en líquido no son ideales debido a movimiento de la muestra durante la adquisición de la imagen puede ocurrir entre sistemas de proyección de imagen, dando lugar a reconstrucciones cambiada de puesto de volúmenes 3D23. Además, es bien sabido que la estabilidad física de las muestras de tejido líquido almacenado es pobre en escalas de tiempo de meses a años, como resultado de inestabilidad química y abrasión de la superficie asociadas con el movimiento de puntos de contacto entre la muestra y la pared () contenedor observaciones personales con muestras de tejido animal y humano fijo).

Para reducir las posibilidades de movimiento de la muestra durante la proyección de imagen, las muestras pueden ser incrustadas en agarosa24,25,26, pero esta práctica está asociada con el riesgo de la mancha de difusión en agarosa, reduciendo así la imagen contraste26. Además, preparaciones de líquido o de agarosa son propensas a daños físicos y se degradan con el tiempo, haciéndolos inadecuados para almacenamiento a largo plazo de la muestra. Razonamos que un método de inmovilización muestra potencialmente exitoso y sencillo podría ser adaptado de la utilizada para microscopía electrónica las muestras. Resinas polimerizadas como EPON 812 (descatalogado y sustituido por EMbed 812) se utilizan comúnmente para proporcionar la dureza necesaria para generar las secciones ultrafinas para microscopia electrónica27,28. De hecho, varios estudios comparativos entre la proyección de imagen de rayos x y microscopía electrónica han demostrado que las muestras encajadas resina pueden ser reflejadas por microscopía de rayos x29,30. Sin embargo, algunas de las prácticas estándar de la microscopia electrónica no se traducen directamente en micro-CT en la proyección de imagen. Por ejemplo, micro-CT en la proyección de imagen de las muestras con cuadrado resina bordes de bloques de resina típica y muestras de esos bloques se asocia con artefactos de difracción de borde que pueden interferir con la proyección de imagen. Suavizar bordes de resina, mientras sea posible, es laborioso y desperdiciador de tiempo.

Mientras que emplean a una gran variedad de resinas plásticas para inclusión en microscopia electrónica, el fondo alta asociado a resinas más difíciles como Embed 812 nos llevó a probar otros. Elegimos LR blanco debido a su baja viscosidad, baja contracción, baja tendencia a las burbujas de forma durante la polimerización y menor fondo. Para crear muestras de borde libre y para reducir al mínimo la cantidad de resina que rodea la muestra, hemos desarrollado los protocolos para dibujar a especimenes en resina líquida en la tubería de polyimide antes de la polimerización. Polyimide fue elegido por su alta estabilidad térmica y alta transmitencia de rayos x para que el retiro de la tubería no es necesario para la proyección de imagen. Por último, hemos diseñado un adaptador personalizado de la micropipeta para nuestra muestra inclusión técnica para confiablemente sostenga el tubo y prevenir la contaminación de Micropipetas. El adaptador puede ser impreso desde un archivo de imagen de CAD 3D. Tomados en conjunto, el objetivo de los métodos de preparación de la muestra presentada aquí es hacer incrustar pequeñas muestras más sencillas, lograr mayor coloración de contraste, inmovilización rígida y almacenamiento a largo plazo de muestras intactas escala milimétrica.

Protocol

Todos los procedimientos en animales vivos fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) en la Universidad Estatal de Pensilvania. 1. día 1: fijación Para mejorar la fijación y reducir el volumen del contenido estomacal, hambre los peces juveniles para por lo menos 24 h para una muestra de 10 mm o más para muestras grandes (e.g., 72 horas para una muestra de 14 mm). Pre-enfriar 10% formol tamponado neutro (NBF) y 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) en hielo a 4 º C. Doble de los peces de agua volumen refrigerado 2 x MS-222 para eutanasia rápida y humana. Esperar 30 s (larvas) a 60 s (juveniles) después el pez deja de moverse. Sumerja el pescado en frío 10% NBF durante 10 minutos. Fijar los peces en solución NBF 10% frío durante la noche en recipientes de fondo plano a temperatura ambiente.Nota: Recipientes de fondo plano se requieren para reducir al mínimo la flexión de la pieza. Soluciones de todos los pasos posteriores y el volumen de fijador deben ser al menos 20 veces el volumen de la muestra a menos que se especifique lo contrario. De 1 a 5 larvas peces cebra, el volumen de la solución recomendada es por lo menos 1 mL. Insuficientes resultados fijadores fijación deficiente y un exceso de volumen de reactivo no afecta negativamente el resultado del procedimiento descrito. Para la fijación completa de peces más grandes, la raja el vientre a partir de algo anterior al poro anal. Utilizar mínima penetración de tijeras o cuchillo y aplicar fuerza apacible a los peces durante el corte para minimizar los daños a órganos internos. Protocolos de fijación han sido descritos por otros31,32,33. 2. día 2: Deshidratación y tinción Enjuague a las muestras fijas 3 veces 1 x de tampón fosfato salino (PBS) pH 7.4 durante 10 minutos. Sumergir las muestras en 35% alcohol etílico (EtOH) por 20 min a temperatura ambiente con agitación suave.Nota: Para todas las medidas de agitación suave, utilice una mesa coctelera y para un efecto de mezcla, cuidadosamente evitando chocar y roce la superficie del recipiente de la muestra. Sumergir las muestras en el 50% EtOH por 20 min a temperatura ambiente con agitación suave. Disolver el polvo de (PTA) ácido fosfotúngstico en agua para preparar una solución stock de 1% w/v. Diluya la solución stock de 1% PTA 3:7 en 100% EtOH para obtener una solución de tinción de PTA de 0.3%. Mancha de las muestras durante la noche en la solución de la PTA de 0.3% a temperatura ambiente con agitación suave. 3. día 3: infiltración Preparar mezcla 1:1 v/v de resina de acrílico 100% EtOH y LR blanco y reservar. Enjuague 3 veces en el 70% EtOH durante 10 minutos. Sumergir las muestras en el 90% EtOH durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. Sumergir las muestras en el 95% EtOH durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. Sumerja las muestras dos veces en 100% EtOH durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. Sumergir las muestras en la mezcla 1:1 EtOH y LR blanco resina de acrílico durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave. 4. día 4: inclusión Sumergir las muestras en un 100%, LR White de la resina por 2 h a temperatura ambiente con agitación suave. Vuelva a colocar la resina en el paso 4.1 con fresco 100% LR blanco resina e incubar 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Montar el aparato de empotrar (figura 1). Cortar tubería de polyimide de adecuado diámetro y longitud.Nota: Se recomienda el tubo con un diámetro interno que es más grande que el diámetro del espécimen por lo menos 0,1 mm. Muestras típicas, se utiliza una longitud estándar de 30 mm de tubo para cada muestra. Cuando se desee, ejemplares alargados pueden ser acomodados usando tubería de más. Coloque una micropipeta P1000 en el extremo ancho del adaptador empotrar e inserte la tubería de polyimide al extremo estrecho (figura 1). Si el adaptador de inclusión no está disponible, vaya al paso 4.3.3. De lo contrario, seguir paso 4.4. Enganche el extremo de una punta de micropipeta directamente a través de tal forma que la tubería de polyimide se ajusta perfectamente. Corte 44 mm desde el extremo ancho de una punta de micropipeta amarillo de 200 μL para la 0,0403″ tubería y 59 mm de la parte inferior de la punta de 1 mL de azul de 0,105″ de tubería. Ajuste según sea necesario. Coloque la punta de la micropipeta cortado en una micropipeta. Transferir las muestras a un barco pequeño pesar o cuenca de solución en forma de V y sumerja completamente las muestras en 100% resina LR White. Con el aparato empotrable de paso 4.3, apuntar la tubería en el extremo ancho de la muestra fija (o hacia la cabeza en el caso de animales) y pipetear a la muestra lentamente en el tubo. Coloque la muestra en medio de la tubería y asegúrese de que el tubo por encima y por debajo de la muestra es llenado con resina. Pipetear la muestra dentro del tubo que la muestra se está moviendo en la dirección natural, hacia adelante.Nota: Pipetear lenta evita burbujas de aire y daños por roces contra el borde del tubo de espécimen. Retroceso en la tubería puede dañar fácilmente las extremidades (extremidades, alas, aletas, etcetera). Se recomienda para permitir algún desbordamiento de resina en el aparato de empotrar para que, más tarde, aire no entra en la tubería durante la extracción. Inmediatamente sellar el extremo abierto con la arcilla de modelado suave a base de aceite. Aplanar la arcilla en una 1 mm de espesor hoja. Estabilizar el tubo entre el índice y los dedos medios. Presione lentamente el barro contra el extremo del tubo con el pulgar. Quitar la arcilla sobrante. Retire el aparato empotrable de la micropipeta. Saque el tubo por rotación suave y sellar el otro extremo con la arcilla. Sostenga un dedo contra el extremo sellado para evitar la expulsión de la arcilla. Empuje lentamente el extremo abierto de la tubería en la arcilla. Coloque el tubo horizontalmente y polimerice la resina durante 24 h a 65 ° C.Nota: Posición Horizontal evita el movimiento de la muestra durante la polimerización. Si una pequeña cantidad de aire atrapada en el paso 4.8, el extremo con la burbuja de aire puede estar elevado un poco para prevenir el movimiento de la burbuja de aire hacia la muestra. Lo importante, demasiada elevación durante la polimerización puede causar el espécimen a caer hacia el extremo inferior debido a la gravedad. Una muestra bien incrustada se muestra frente a uno con una burbuja de aire, que debe ser evitada porque la refracción de las interfaces de aire/de la resina puede degradar la calidad de la imagen (figura 2). 5. día 5: colección Recolectar las muestras para la adquisición de la imagen al final del día 5.Nota: El retiro de la tubería de polyimide es posible pero no necesaria para la proyección de imagen. Basado en el sincrotrón micro-CT en la proyección de imagen para la muestra de pez cebra fue realizada en línea 2-BM en avanzada del fotón fuente (APS) en laboratorio nacional de Argonne (Lemont, IL, USA). Pez cebra manchada de PTA, se determinó un rango de energía de rayos x óptima de 5-30 keV, y una energía de rayos x de 13.8 keV fue utilizado para la proyección de imagen. proyecciones de 1501 se obtuvieron en 13.8 keV sobre 180 grados (1 proyección cada 0,12 grados) con una cámara de 2048 por 2048 píxeles. Además, también se adquirieron dos imágenes de campo plano (ganancia) (uno al principio) y al final de la adquisición y una imagen de campo oscuro. Se realizaron correcciones plana-campo y campo oscuro, reducción de artefactos de anillo y reconstrucción de la imagen el uso del open source TomoPy toolkit34. Muestras de Daphnia y Drosophila teñido de PTA se reflejada en un microscopio de rayos x12,35. Configuraciones específicas de micro-CT son dependientes en el objeto y la calidad de la mancha. Por ejemplo, la muestra de Drosophila fue analizada en 40 kVp, 74 mA y 15 s con una resolución de voxel de 3.10 x 3.10 x 3.10 μm3.

Representative Results

El protocolo había descrito detalles el procedimiento de preparación de muestra para las larvas de pez cebra entera y juveniles para micro-CT en la proyección de imagen. En particular, este método es fácilmente adaptarse a otros tipos de muestras (por ej., Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, órganos de ratón). Tiempos de incubación en varios pasos son apropiados para las larvas de pez cebra y las muestras de tamaño similar; muestras más grandes pueden requerir incubación más largo. Para ayudar con la muestra de incrustación pasos, hemos diseñado un adaptador que se conecta a una micropipeta de 1 mL y puede ser personalizado para varios tamaños de poliimida (figura 1) de la tubería. Este adaptador personalizado era 3D impreso de un archivo CAD que es asociado con este manuscrito y disponible para su descarga en http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Puesto que todos los lectores no tengan acceso a una impresora 3D, montaje de un aparato casero de empotrar utilizando puntas de micropipeta es descrito en el protocolo (paso 4.3). Una larva de pez cebra con éxito incrustado se muestra en comparación con un modelo con una burbuja de aire (figura 2), que probablemente se degradará la calidad de imagen. Para demostrar la versatilidad del procedimiento de inclusión, muestran los especímenes de diversos organismos modelo (es decir., Danio, Drosophila, Daphnia, embrión de ratón) que han pasado a través de la muestra preparación pipeline ( Figura 3). Volúmenes en 3D reconstruidos de todo muestras de Danio, Daphniay Drosophila reflejadas por micro-CT se muestran (figura 4). Importante, como lo demuestra la muestra de Danio , estas muestras pueden ser almacenadas durante un período prolongado de tiempo y reutilizadas para múltiples sesiones de proyección de imagen (figura 5). Figura 1. Incorporar aparatos. (A) un adaptador fue diseñado para facilitar la fijación mediante herramientas comunes de laboratorio. (B) una ilustración transversal del adaptador. (C) incrustar el aparato después de la inserción de la tubería de polyimide en punto del adaptador (a) y colocar la micropipeta en el punto del adaptador (c). Segmento de adaptador (b) es una cámara de desbordamiento para acomodar el exceso de resina y proteger la micropipeta de contaminación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Especímenes incrustados con éxito están desprovistos de las burbujas de aire. (A) un encajado 3 días después fertilización (PD) larvales pez cebra sin burbuja de aire. (B) un embedded 3 PD pez cebra con una burbuja de aire. El aire atrapado durante el proceso de inclusión puede moverse hacia la muestra si la muestra no se coloca horizontalmente durante la polimerización. Barras de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Una gran variedad de especímenes puede ser embebida con nuestro protocolo de. (A) larva de pez cebra de PD 7. (B) adulto de Drosophila. (C) adulto Daphnia. (D) embrión de ratón. Muestras más grandes como el embrión de ratón se acomodan por unas modificaciones al Protocolo. Brevemente, la tubería de polyimide se llena 1/3 de su longitud con la resina y polimerizada antes. Muestra fija y manchada se colocó encima de la resina previamente polimerizada. El tubo se llenó entonces de resina no polimerizada, seguida por una segunda polimerización. La tubería de polyimide se retiró antes de la fotografía para permitir la mejor visualización de la muestra en esta figura. El retiro de la tubería no es necesario para la adquisición de la imagen exitosa por las barras de escala micro-CT.: imágenes de muestras, 5 mm; ampliada de inserciones, 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. 3 dimensiones renders de especímenes incrustados. (A) larva de pez cebra PD 3 en el × 0.743 0.743 × 0.743 μm3 voxel resolución reconstruida. (B) reconstruir adultos Daphnia (3 × 3 × 3 μm3 voxel resolución). (C) reconstruido adulto Drosophila (3.1 × 3.1 × 3.1 μm3 voxel resolución). Digitales secciones transversales se pueden generar a cualquier ángulo como se muestra en la columna de la izquierda. Representaciones superficiales aparecen a la derecha, prestados utilizando software comercial. Incrustación de resina se puede ver en todas las exploraciones fuera de la muestra (por *), pero no interfiere con la muestra sí mismo. La larva de pez cebra era reflejada en el laboratorio nacional de Argonne en la fuente del fotón avanzada basada en el sincrotrón. Los especímenes de Daphnia o Drosophila se fotografiada con un microscopio de rayos x comercial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5. Las muestras con nuestro protocolo se pueden volver a imagen con micro-CT. La larva de pez cebra 5 PD mismo era reflejada en 2011 (A) y (B) 2013, presentado como proyecciones de la intensidad media de la vista sagital. Comparación de imagen entre escaneados después del almacenamiento indica la preservación de características anatómicas. Primer plano (C) una de músculo de ambas exploraciones se presenta con líneas segmentadas que indican las regiones correspondientes utilizadas para generación de perfiles de intensidad (D). Perfiles de intensidad normalizados sus correspondientes promedios a lo largo de líneas muestran coincidencia espacial de picos locales en ambas exploraciones. (E) promedio de valores de intensidad para regiones seleccionadas en el A y B perteneciente al fondo, púrpura, núcleos neuronales (N, verde), materia blanca (W, azul) y el músculo (M, naranja) fueron divididas por un promedio de fondo (blanco) y para generar la señal a ruido relaciones (SNR), que corresponde bien entre exploraciones. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este manuscrito, se presentan un protocolo detallado para la inmovilización rígida de escala milimétrica fija y teñida especímenes (0.5 a 2.5 mm de diámetro) para micro-CT en la proyección de imagen. Dado el rápido avance de la tecnología micro-CT en cuanto a velocidad y resolución, un método de preservación de la muestra permanente con volver a la proyección de imagen capacidades es altamente deseable. Tradicionalmente, densa resina de empotrar se utilizan en microscopía electrónica de soporte estructural para cortar secciones ultrafinas y minimizar el daño a la muestra. Nuestro método había adaptado su uso para la inmovilización rígida durante la proyección de imagen no destructivo. Para minimizar los artefactos de la imagen de la presencia de exceso de resina, hemos implementado el uso de tubería de polyimide transparente de rayos x para crear muestras redondeos sin bordes y para restringir el volumen de resina alrededor de la muestra.

Resultado óptimo del procedimiento de inclusión está supeditada a la cuidadosa ejecución de varios pasos críticos y atención a la integridad de la muestra durante todo el procedimiento. De hecho, dañar a la muestra resultará en una comprometida imagen final sin importar el éxito de la ejecución de la proyección de imagen. Refrigeración contribuye a una disminución de las respuestas de dolor, y tejido no fijada se degrada más rápidamente en temperaturas más altas, utilizamos reactivos previamente enfriados. Especímenes grandes pueden necesitar ser cortado para permitir la entrada de fijador en el interior de la muestra para que los órganos internos como el hígado, el páncreas y el intestino son completamente fijos. Interpretaciones de los tejidos se deterioran y pierden integridad estructural, destrucción de la estructura biológica. Otro paso clave es mantener a la muestra en su alineación natural. Por lo tanto, abogamos por el uso de recipientes con fondo plano, que utilizamos durante todo el procedimiento y son particularmente importantes durante la fijación. Fijación polipropileno tubos o tubos cónicos que suelen tienen un fondo en forma de V deben evitarse ya que pueden causar muestras alargadas al doble, que distorsiona la morfología natural de la muestra. Además, para minimizar el uso de la resina, el diámetro interno de la tubería de polyimide es sólo ligeramente más grande que el ancho del espécimen. Flexión de la pieza también puede resultar en daños a la muestra como entra en el tubo. Se recomienda también para transferir a la muestra en el tubo de forma natural hacia adelante para evitar dañar las extremidades. Deshidratación adecuada es un paso crítico. Esto se logra con pequeños incrementos de aumento de las concentraciones de EtOH a reemplazar lentamente agua con EtOH, que es más miscible con la resina. Grandes aumentos en la concentración de EtOH se asocian con la contracción del tejido y pueden ser mejorados por incrementos adicionales de incubación EtOH a hacer la transición más gradual. Por último, para minimizar el movimiento de la muestra o bolsas de aire, si hay alguna, las muestras se colocan horizontalmente durante la polimerización de la resina (final del día 4). Bolsas de aire o sellador al lado de la muestra provoca artefactos ópticos con proyección de imagen de rayos x asociada con la difracción de borde, reducción de la calidad de la imagen.

Con respecto a posibles modificaciones en el protocolo, empotrar resinas y metales las manchas se pueden utilizar en lugar de acrílico blanco LR y PTA, respectivamente. Embed812, una resina de epoxy utilizada en microscopia electrónica, es altamente viscosa, más difícil de transferir, puede causar la distorsión de las muestras y se asocia con fondo mayor que las resinas de metacrilato acrílico o glicol. Mientras que JB4, una metacrilato de glicol, es menos viscoso que el EMbed812 y tiene fondo inferior, formación aleatoria de bolsas de aire aparecen con frecuencia en las proximidades de la muestra. Como se mencionó, bolsas de aire degradan la calidad de imagen y son particularmente problemáticos para las muestras preciosas. Cabe destacar que Technovit 7100, otro metacrilato de glicol, interfiere con la coloración de la PTA, resultando en pobre contraste en la imagen final. Comparativamente, acrílico blanco LR tiene agua como viscosidad, bajo fondo y no interfiere con la PTA coloración. En nuestras manos, la tasa de éxito de incrustación en LR blanco sin burbujas de aire o daño de la muestra es superior al 95%. Por ello, abogamos por su uso como la resina de empotrar para tejido micro-CT. Con respecto a las manchas, las manchas del resultado de varios metales como el tetróxido de osmio, yodo, y PTA en micro-CT en la proyección de imagen ha sido comparado y discutido en otra parte15,16,17 y queda fuera del alcance de este manuscrito.

El tamaño de muestra es una limitación importante a nuestro protocolo actual. Puesto que empleamos succión para transferir a las muestras en el tubo, la habilidad de ver a la muestra es crítica para la orientación y asegurar que está de hecho en la tubería. Como resultado, submilimétrica muestras como tardígrado (es decir., osos de agua) son muy difíciles de integrar porque requieren el uso de un microscopio para visualizar. Una vez que se aplica succión, muestras microscópicas son fácilmente perdidas desde el plano focal y se convierten en un reto a descubrir, lo que es difícil determinar si pasaron demasiado el extremo atado de la tubería. Muestras más grandes, tales como embriones de ratón, (3-10 mm) pueden ser incrustadas con ligeras modificaciones en el protocolo de inclusión (figura 4). En particular, la tubería de polyimide fue llenada con resina líquida, que se polimeriza antes de 1/3. La muestra fija y manchada se colocó encima de la resina previamente polimerizada. La tubería fue completamente llenada con resina no polimerizada y seguida por una segunda polimerización.

La importancia de nuestro protocolo de inclusión es múltiple. Muestras de animal o tejido todo rígidamente inmovilizadas son deseables por razones incluyendo: (1) creación de repositorios a largo plazo de muestras que son difíciles de generar o preparar; (2) la adquisición de datos; (3) lo que permite proyección de imagen serial utilizando múltiples modalidades de imágenes; y (4) proporcionar estándares para calibración y desarrollo tecnológico. Muestras preparadas con nuestro procedimiento de inclusión son en resina sólida que es resistente contra daños y pueden por lo tanto, ser fácilmente almacenadas tal vez indefinidamente. Almacenamiento a largo plazo es particularmente útil para especímenes raros o laboriosamente generados como las asociadas con proyectos de fenomas. Además, en caso de que los datos digitales se pierden, se pueden generar los datos de la muestra original. La capacidad de volver a la proyección de imagen durante un largo período de tiempo potencialmente permite la misma muestra ser interrogado con más avanzadas modalidades de imagen en el futuro. Puesto que las muestras son físicamente estables entre instancias de imágenes, imágenes se adquieren de la misma muestra en la misma orientación, facilitando el registro entre conjuntos de datos anteriores y posteriores. Por ejemplo, una imagen de baja resolución sólo puede permitir la segmentación de los tejidos en una larva de pez cebra. La misma larva puede más tarde ser volver a reflejada en mayor resolución para que el más detallan Análisis computacionales en la resolución de celular. Esta capacidad de comparación directa entre exploraciones registradas sugiere muestras embebido en resina como un potencial para el desarrollo de la tecnología de micro-CT. Pueden evaluar los efectos de cualquier modificación al método de proyección de imagen de proyección de imagen de la misma muestra que se controlan todas las variables en el paso de preparación de la muestra. Finalmente, puede utilizarse una muestra estándar embebido en resina para calibración de instrumentos para comprobar la consistencia de la imagen.

Nuestro trabajo previo examen de histología de peces mutantes y enfermos demostraron que resolución celular permite la detección de anormalidades sutiles en la estructura del tejido que son pasados por alto en la examinación gruesa mediante la disección microscopio36o a baja potencia Microscopio estéreo. Queremos ampliar nuestros análisis de alta resolución en muestras humanas. Las larvas de pez cebra, que constituyen al tema principal de nuestra labor de desarrollo, son similares a las biopsias de aguja humano en su fragilidad, heterogeneidad del tejido intercelular y celular, tamaño (1-3 mm de diámetro) y forma alargada. Basado en nuestra amplia experiencia con el pez cebra y otros trabajos mostrando que micro-CT con éxito teñido y analizado tejido humano, aunque a menor resolución37, esperamos que nuestros enfoques para aportar valor añadido a la proyección de imagen y análisis de las biopsias de la aguja. Nosotros hemos estimado que el montaje de un kit suficiente para una preparación de hasta 20 muestras de la misma condición que potencialmente menos de 30 USD. Las muestras preparadas por nuestro método de empotrar son resistente al daño físico y por lo tanto fácil de transportar. El bajo costo y facilidad de transporte sugieren la posibilidad de recogida de muestras de todo el mundo, particularmente las áreas en que la proyección de imagen de resolución celular con micro-CT no es accesible. Nuestra visión es para archivos digitales de alta resolución de las biopsias de la aguja (desde 0,1 hasta varios terabytes) para permitir la creación de un atlas digital de tejidos humanos y al mismo tiempo permitir a los investigadores a perfeccionar y mejorar la actual tuberías de análisis para localización y caracterización cuantitativa de la arquitectura celular y tejido en el contexto completamente en 3D de los tejidos analizados.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Roland Myers por favor proporcionar los protocolos originales de TEM. Además, nos gustaría agradecer al Dr. John Colbourne para proporcionar a la muestra de Daphnia , Dr. Santhosh Girirajan para proporcionar a la muestra de Drosophila y Dr. Fadia Kamal para dar el embrión de ratón. Los investigadores reconocen apoyo financiero del NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), los laboratorios de Gittlen Jake para investigación del cáncer y de premio piloto fondos de los institutos de Huck de la PSU de Ciencias de la vida y el Instituto de CyberScience.

Materials

10X Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4
Phosphotunstic Acid VWR MK282402
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical MS-222
LR White Electron Microscopy Sciences 14380
Polyimide tubing (ID 0.04") Nordson Medical 141-0065 The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request.
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200
Oil-based soft modeling clay Sculpey S302 001
Micropipette P200 Gilson F123601
Micropipette P1000 Gilson F123502
Glass vials VWR 66015-042
V-shaped basin VWR 89094-676
Weigh boats VWR 10803-148
200 μL yellow micropipette tip Fisher Scientific 02-707-500
1 mL blue micropipette tip Fisher Scientific 02-681-163
Tabletop shaker Thermolyne M71735
Camera Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD
X-ray microscope Zeiss Xradia 520 Versa
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References

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Lin, A. Y., Ding, Y., Vanselow, D. J., Katz, S. R., Yakovlev, M. A., Clark, D. P., Mandrell, D., Copper, J. E., van Rossum, D. B., Cheng, K. C. Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58293, doi:10.3791/58293 (2018).
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