Wij protocollen ontwikkeld en ontworpen een aangepaste apparatuur om insluiten van millimeter-schaal specimens. We presenteren monsterbereidingsprocedures met de nadruk op het insluiten in acryl hars en polyimide buizen om rigide immobilisatie en langdurige opslag van specimens voor de ondervraging van architectuur en cel morfologie van weefsels door micro-CT.
Meer dan honderd jaar, is het histologisch onderzoek van weefsels al de gouden standaard voor medische diagnose omdat histologie alle celtypes in elk weefsel toestaat kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Ons laboratorium is actief bezig om technologische vooruitgang maken in X-ray micro-berekend tomografie (micro-CT) die de diagnostische kracht van histologie aan de studie van volledige weefsel volumes bij cellulaire resolutie zal brengen (dwz., een röntgenfoto Histo-tomography modaliteit). Richting van dit doel hebben we gerichte verbeteringen in de sample voorbereiding pijpleiding. Één van de belangrijkste optimalisatie, en de focus van het huidige werk, is een eenvoudige methode voor het insluiten van de rigide van vaste en gebeitst millimeter-schaal monsters. Veel van de gepubliceerde methoden voor monster immobilisatie en oereenstemming micro-CT beeldvorming vertrouwen op het plaatsen van de monsters in paraffine, agarose of vloeistoffen zoals alcohol. Onze aanpak strekt zich uit dit werk met aangepaste procedures en het ontwerp van een 3-dimensionale afdrukbare toestel niet blootstellen aan de monsters in een acryl hars rechtstreeks insluiten in polyimide buizen, die relatief transparant aan x-stralen. Hierin worden monsterbereidingsprocedures beschreven voor de monsters van 0,5 tot 10 mm in diameter, die geschikt voor hele zebrafish larven en jonge exemplaren, of andere dieren zijn zou en weefselsteekproeven met vergelijkbare afmetingen. Als bewijs van concept, hebben wij ingesloten de specimens van Danio, Drosophila, Daphniaen een muis embryo; representatieve beelden van 3-dimensionale scans voor drie van deze monsters worden weergegeven. Belangrijk is dat leidt onze methodologie tot meerdere voordelen, met inbegrip van rigide immobilisatie, op lange termijn behoud van hulpbronnen moeizaam gemaakt, en de mogelijkheid om opnieuw het ondervragen van monsters.
Fenotypen zijn waarneembare kenmerken van een organisme dat de gevolgen van unieke interacties tussen haar genetische achtergrond en het milieu vertegenwoordigen. Deze kenmerken kunnen gedrags, biochemische, morfologische, ontwikkelingsstoornissen en/of fysiologische eigenschappen bevatten. Nog belangrijker is, kunnen verschillen in kenmerken tussen wild-type organismen en genetische mutanten bieden belangrijke inzicht in de mechanismen en de functies van de betrokken genen. Met betrekking tot de morfologie, Histopathologie is de gouden standaard voor de beoordeling van de fenotypen op cellulair niveau maar lijdt aan mechanische artefacten en kan geen nauwkeurige kwantitatieve analyse van de volumetric1. Ons laboratorium is gemotiveerd om de belemmeringen voor de toepassing van de diagnostische kracht van histologie naar volledige weefsel volumes bij submicron resolutie.
Een overzicht van beschikbare technologieën suggereert dat beeldvorming door X-ray micro-berekend tomografie (micro-CT) voorschrijven ideale vermogens die nodig zijn voor millimeter-schaal geheel-dier 3-dimensionale (3D) histologie. Micro-CT maakt niet-destructief, isotrope, 3D visualisatie en de mogelijkheid om het kwantitatieve analyse van weefsel het platform1,2. In de afgelopen jaren 3D beeldvorming van onbevlekt en metaal gebeitste zebrafish door micro-CT heeft opgedaan steeds tractie en is gebruikt voor volumetric analyse van verschillende weefsels, met inbegrip van spier-, tanden-, bot- en vetweefsel3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andere modelorganismen en weefsel exemplaren zijn ook vatbaar voor micro-CT beeldvorming. Bijvoorbeeld, is een pijpleiding geïntroduceerd voor het kwantificeren van de neuroanatomie van het dichte MESOSCHAAL van muis hersenen beeld via synchrotron micro-CT11. Een op basis van eosine kleuring protocol blijkt ook geschikt voor zacht weefsel micro-CT beeldvorming van hele muis organen12. Morfometrische analyse van onbevlekt menselijke L3 wervels en de visualisatie van zilver gebeitste menselijke longen met behulp van micro-CT is gebleken dat het nut van deze technologie voor menselijke monsters13,14.
Om het actualiseren van de grote belofte van micro-CT voor volledige morfologische fenotypering van intact kleine dieren en weefsel monsters, moet een aantal hindernissen worden overwonnen met betrekking tot resolutie, veld-of-view, doorvoer, uitgebreide cel kleuring, en behoud op lange termijn. Terwijl elk van deze aspecten is van cruciaal belang, is de focus van het huidige manuscript de optimalisatie van insluiten procedures, met extra notities steekproef fixatie en kleuring. Heavy metal kleuring is nuttig omdat het inherente contrast tussen verschillende zachte weefsels in micro-CT-beelden laag is. De potentie van verschillende metalen vlekken, zoals osmium tetroxide, jodium, phosphotungstic zuur (PTA) en gallocyanin-chromalum, ter verbetering van contrast voor micro-CT beeldvorming geweest bestudeerde15,16,17. Uranyl acetaat is ook gebruikt als een contrasterende agent voor micro-CT beeldvorming van botten en het kraakbeen18,19. PTA zoals gebruikt in ons protocol leidt tot consistente kleuring van bijna alle weefsels en cellen in de hele zebrafish specimens, levert beelden die potentieel compatibel zijn met histologie-achtige studies via volledige volumes van weefsel.
Tijdens micro-CT Beeldacquisitie, een 2-dimensionale (2D) projectie is genomen zoals het monster wordt gedraaid door een fractie van een graad en herhaald totdat het monster is voltooid een 180° en 360° rotatie, het genereren van een aantal duizenden 2D projecties gebruikt voor de reconstructie van het 3D-volume20. In dit proces, verstoring van het specimen zal leiden tot de overeenkomstige 2D projecties to be out of uitlijning, resulterend in slecht gereconstrueerde 3D volumes. Monster immobilisatie is een manier om te corrigeren voor dit probleem en enkele huidige strategieën betrekken inlaten van het monster in alcohol of in te sluiten in de agarose in polypropyleen tubes of micropipet tips3,5,15, 16 , 21 , 22. vloeibare onderdompeling methoden zijn niet ideaal, omdat de beweging van het monster gedurende de Beeldacquisitie tussen imaging sets optreden kan, resulterend in verschoven reconstructies van 3D volumes23. Verder, het is algemeen bekend dat de fysieke stabiliteit van vloeistof-opgeslagen weefselsteekproeven slecht in termijnen van maanden tot jaren, als gevolg van chemische instabiliteit en oppervlakte schuren verkeer van contactpunten tussen monster en de (muur) container zijn gekoppeld is persoonlijke opmerkingen te maken met vaste weefselsteekproeven op het gebied van mens en dier).
Verklein het potentieel voor monster beweging tijdens imaging en monsters kunnen worden ingebed in de agarose24,25,26, maar deze praktijk wordt geassocieerd met het risico van de vlek verspreiden in agarose waardoor de afbeelding contrast26. Bovendien, vloeistof of agarose preparaten zijn gevoelig voor fysieke schade en degraderen na verloop van tijd, waardoor ze ongeschikt zijn voor langdurige opslag van het monster. We redeneerde dat een potentieel succesvol en ongecompliceerd monster immobilisatie methode aangepast van die gebruikt voor elektronenmicroscopie specimens worden kan. Gepolymeriseerde harsen zoals EPON 812 (stopgezet en vervangen door insluiten 812) worden vaak gebruikt om de hardheid vereist voor het genereren van uiterst dunne secties voor elektronenmicroscopie27,28. Inderdaad, hebben de verschillende vergelijkende studies tussen X-ray beeldvorming en elektronenmicroscopie aangetoond dat de monsters in de hars ingesloten image kunnen worden gemaakt door X-ray microscopie29,30. Sommige van de standaardprocedures van elektronenmicroscopie Vertaal echter niet rechtstreeks naar micro-CT beeldvorming. Bijvoorbeeld, micro-CT beeldvorming van monsters met een kwadraat hars randen van typische hars blokken en monsters gesneden uit die blokken wordt geassocieerd met rand diffractie artefacten die met imaging interfereren kunnen. Vloeiende randen van hars, terwijl het mogelijk is moeizaam en tijdrovend.
Hoewel een verscheidenheid van kunststof insluiten harsen zijn werkzaam in elektronenmicroscopie, leidde de hoge achtergrond gekoppeld moeilijker harsen zoals insluiten 812 ons naar het testen van anderen. Wij kozen LR White wegens haar lage viscositeit, lage inkrimping, lage neiging om vorm bubbels gedurende de polymerisatie en lagere achtergrond. Wilt maken van rand-gratis monsters, en om te minimaliseren van de hoeveelheid hars die rond het monster, ontwikkelden we de protocollen om te tekenen van specimens in vloeibare hars in polyimide buis vóór de polymerisatie. Polyimide werd gekozen voor de hoge thermische stabiliteit en hoge X-ray doorlating zodat de verwijdering van de leidingen niet noodzakelijk voor de beeldvorming is. Tot slot, we ontwierpen een aangepaste micropipet adapter voor onze steekproef inbedding techniek om betrouwbaar de buis te houden en te voorkomen dat de besmetting van micropipetten. De adapter kunnen 3D afgedrukt van een CAD-afbeeldingsbestand. Samen genomen, is het doel van de steekproef bereidingswijzen hier gepresenteerd maken inbedding van kleine steekproeven eenvoudiger te bereiken verbeterd contrast, rigide immobilisatie en langdurige opslag van intact millimeter-schaal specimens kleuring.
In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd protocol voor rigide immobilisatie van vaste en gebeitst millimeter-schaal (0,5 tot en met 2.5 mm doorsnede) exemplaren voor micro-CT beeldvorming. Gezien de snelle opmars van micro-CT technologie met betrekking tot de resolutie en snelheid, is een methode van permanente monster behoud met opnieuw imaging mogelijkheden zeer wenselijk. Traditioneel, dichte inbedding hars worden vaak gebruikt in elektronenmicroscopie om structurele ondersteuning om te knippen uiterst dunne secties en minimaliseren van de schade aan het model. Onze methode aangepast het gebruik ervan voor rigide immobilisatie tijdens niet-destructieve beeldbewerking. Om te minimaliseren van de beeldvorming artefacten uit de aanwezigheid van overtollige hars, hebben wij het gebruik van X-ray transparante polyimide buis ronde monsters zonder randen maken, en het beperken van de hoeveelheid hars rond het monster.
Optimale resultaten van de insluiten procedure is afhankelijk van de zorgvuldige uitvoering van verschillende kritische stappen en aandacht voor de integriteit van het monster gedurende de hele procedure. Inderdaad, beschadiging van het specimen zal resulteren in een gecompromitteerde eindbeeld ongeacht het succes van de uitvoering van de beeldvorming. Aangezien koelen draagt bij tot een vermindering van de pijn reacties, en losse weefsel sneller bij hogere temperaturen degradeert, gebruiken we vooraf gekoeld reagentia. Grote exemplaren wellicht worden gesneden zodat de post van fixeerspray in de binnenkant van het specimen zodat de inwendige organen zoals lever, alvleesklier en darm worden volledig opgelost. Nietgefixeerde weefsels verslechteren en structurele integriteit, vernietiging van biologische structuur verliest. Een andere belangrijke stap is het handhaven van het model in de natuurlijke uitlijning. Wij pleiten daarom voor het gebruik van platbodem containers, die we in de gehele procedure en zijn met name belangrijk tijdens fixatie gebruiken. Fixatie in polypropyleen tubes of conische buisjes die meestal een V-vormige bodem hebben moeten worden vermeden omdat ze leiden een verlengde monsters tot kunnen te buigen, die verstoort de natuurlijke morfologie van het model. Bovendien, om te minimaliseren van het gebruik van hars, is de binnendiameter van de buis van polyimide slechts iets groter dan de breedte van het model. Buigen van het model kan ook leiden tot schade aan het model als het binnenkomt de buis. Het is ook aanbevolen om de overdracht van het model in de slang op een natuurlijke voorwaartse manier om te voorkomen dat schadelijke extremiteiten. Juiste uitdroging is een andere kritische stap. Dit wordt bereikt met kleine stappen van toenemende EtOH concentraties te langzaam vervangen door water EtOH, die is meer mengbaar met de hars. Grote stijgingen van de EtOH concentratie worden geassocieerd met weefsel krimp en kunnen worden verbeterd door extra stappen van EtOH incubatie te maken de overgang geleidelijker. Tot slot, om te minimaliseren van het verkeer van het model of de luchtzakken, als die er zijn, de monsters zijn horizontaal geplaatst tijdens de polymerisatie van hars (eind van dag 4). Luchtzakken of sealant naast het model veroorzaakt optische artefacten met X-ray beeldvorming rand diffractie, vermindering van de beeldkwaliteit is gekoppeld.
Met betrekking tot eventuele wijzigingen in het protocol, andere insluiten harsen en metaal vlekken kunnen worden gebruikt in plaats van LR White acryl en PTA, respectievelijk. Embed812, een veelgebruikte elektronenmicroscopie, epoxyhars is zeer viskeuze, moeilijker om te dragen, kan de vervorming van de specimens en wordt geassocieerd met hogere achtergrond dan acryl of glycol methacrylaat harsen. Terwijl JB4 Plus, een glycol-methacrylaat, is minder viskeuze dan EMbed812 en lagere achtergrond heeft, willekeurige vorming van luchtzakken vaak verschijnen in de nabijheid van het model. Zoals vermeld, luchtzakken de afbeeldingskwaliteit en zijn bijzonder problematisch voor kostbare monsters. Het is vermeldenswaard dat Technovit 7100, een ander glycol methacrylaat, interfereert met het PTA kleuring, resulterend in slechte contrast in de uiteindelijke afbeelding. Betrekkelijk, LR White acryl heeft water-achtige viscositeit, lage achtergrond, en interfereert niet met het PTA kleuring. In onze handen is het slagingspercentage van inbedding in LR wit zonder schade of lucht bubbels van de steekproef groter dan 95%. Om deze redenen pleiten wij voor het gebruik ervan als de inbedding hars voor weefsel micro-CT. Met betrekking tot de vlekken, het resultaat van verschillende metalen vlekken zoals osmium tetroxide, jodium, en PTA in micro-CT beeldvorming is vergeleken en besproken elders15,16,17 en is buiten het toepassingsgebied van deze manuscript.
De grootte van de steekproef is een belangrijke beperking bij onze huidige protocol. Aangezien we employ zuig specimens overbrengen naar de buis, is de mogelijkheid om te zien van het model van cruciaal belang voor oriëntatie en ervoor te zorgen dat het is inderdaad in de buis. Dientengevolge, sub millimeter monsters zoals beerdiertjes (dwz., water beren) zijn uiterst moeilijk te sluiten omdat ze vereisen het gebruik van een microscoop om te worden gevisualiseerd. Zodra afzuiging wordt toegepast, microscopische exemplaren zijn gemakkelijk verloren van het brandvlak en uitdagend om te herontdekken, waardoor het moeilijk is om te bepalen als zij te ver via het bijgevoegde einde van de buis doorgegeven. Grotere monsters, zoals muis embryo’s (3-10 mm) kunnen worden ingebed met kleine aanpassingen aan het insluiten protocol (Figuur 4 d). In het bijzonder was de polyimide buis gevuld tot 1/3 met vloeibare hars, die was polymeervorm vóór het insluiten. De vaste en gebeitst monster was geplaatst op de top van de vooraf gepolymeriseerde hars. De buis was vervolgens volledig gevuld met un-gepolymeriseerde hars en gevolgd door een tweede polymerisatie.
De betekenis van onze insluiten protocol is spruitstuk. Rigide geïmmobiliseerdet hele dier of weefsel exemplaren zijn wenselijk voor redenen, waaronder: (1) maken op lange termijn repositories van monsters die moeilijk te genereren of voor te bereiden; (2) opnieuw overname van gegevens; (3) waardoor seriële beeldvorming met behulp van meerdere beeldvormende modaliteiten; en (4) bieden normen voor kalibratie en technologische ontwikkeling. Monsters met onze insluiten procedure bereid zijn ingekapseld in solide hars die is veerkrachtig tegen schade en kunnen daarom worden gemakkelijk opgeslagen misschien voor onbepaalde tijd. Langdurige opslag is vooral handig voor zeldzame of moeizaam gegenereerde specimens zoals die verband houden met phenome projecten. Verder, in het geval dat de digitale gegevens verloren zijn, de gegevens kunnen worden gegenereerd uit het oorspronkelijke monster. Het vermogen van het opnieuw imaging gedurende een lange periode van tijd mogelijk maakt hetzelfde monster te worden ondervraagd met meer geavanceerde imaging modaliteiten in de toekomst. Aangezien de monsters fysiek stabiel tussen imaging exemplaren zijn, worden beelden verkregen uit het hetzelfde model in dezelfde afdrukstand, vergemakkelijking van registratie tussen eerdere en latere data sets. Bijvoorbeeld, kan een lage resolutie afbeelding alleen segmentatie van weefsels in de larve van een zebravis toestaan. De larve van de dezelfde kan later opnieuw bij hogere resolutie zijn beeld, zodat meer computationele analyses op cellulaire resolutie gedetailleerde. Deze mogelijkheid voor directe vergelijking tussen geregistreerde scans suggereert hars-embedded monsters als een potentieel standaard voor technologische ontwikkeling van micro-CT. De gevolgen van elke wijziging in de imaging-methode kunnen worden geëvalueerd door imaging van hetzelfde monster, zodat alle variabelen in de steekproef voorbereiding stap worden gecontroleerd. Tenslotte, een standaardmonster hars-embedded kan gebruikt worden voor het kalibreren van het instrument om te testen voor consistentie voor imaging.
Onze vorige werk mutant en zieke vis histologie onderzoeken bleek dat cellulaire resolutie maakt de ontdekking van subtiele afwijkingen in weefsel structuur die over het hoofd zijn gezien bij bruto onderzoek met behulp van het ontleden Microscoop36, of een spaarstand stereomicroscoop. Wij wensen uit te breiden onze high-resolution analyses naar menselijke specimens. Zebravis larven, die bestaan uit het primaire onderwerp van ons ontwikkelingswerk, zijn vergelijkbaar met menselijke naald biopsieën in hun kwetsbaarheid, cellulaire en intercellulaire weefsel heterogeniteit grootte (1-3 mm doorsnede) en langwerpige vorm. Op basis van onze uitgebreide ervaring met zebravis en andere werk toont dat micro-CT met succes gekleurd en gescand van menselijk weefsel, zij het op een lagere resolutie37, verwachten we onze benaderingen van toegevoegde waarde bieden aan de beeldvorming en analyse van naald biopsieën. Wij schatten dat de vergadering van een kit voldoende voor één preparaat van maximaal 20 monsters van dezelfde voorwaarde als potentieel minder dan 30 USD. De monsters worden bereid door onze verzonken methode resistent zijn tegen fysieke schade en dus makkelijk te vervoeren. De lage kosten en het gemak van vervoer suggereren de mogelijkheid van het verzamelen van monsters van over de hele wereld, met name in sectoren waarin cellulaire resolutie beeldvorming met micro-CT niet gemakkelijk toegankelijk is. Onze visie is voor hoge resolutie digitale bestanden van naald biopten (variërend van 0.1 tot verschillende terabytes) het inschakelen van het creëren van een digitale atlas van de menselijke weefsels, en tegelijkertijd de onderzoekers te verfijnen en te verbeteren huidige analyse pijpleidingen voor lokalisatie en kwantitatieve karakterisering van cellulaire en weefsel architectuur in het volledige 3D-kader van de weefsels gescand.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Roland Myers voor het vriendelijk het verstrekken van de oorspronkelijke TEM-protocollen. Daarnaast zouden we graag bedanken Dr. John Colbourne voor het verstrekken van de Daphnia -specimen, Dr. Santhosh Girirajan voor het verstrekken van de Drosophila specimen en Dr. Fadia Kamal voor het verstrekken van het embryo van de muis. De onderzoekers erkennen financiering van de steun van de NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), de Jake Gittlen laboratoria voor kankeronderzoek, en van de pilot award financiering uit de PSU Huck instituten van de biowetenschappen en het Instituut voor CyberScience.
10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
Glass vials | VWR | 66015-042 | |
V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |