Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata
Summary
Abbiamo sviluppato protocolli e progettato un apparecchio personalizzato per abilitare l’incorporamento degli esemplari di scala del millimetro. Vi presentiamo le procedure di preparazione del campione con un’enfasi sull’integrazione in resina acrilica e polyimide tubazione per raggiungere immobilizzazione rigida e archiviazione a lungo termine degli esemplari per l’interrogatorio di morfologia delle cellule e l’architettura del tessuto dal micro-CT.
Abstract
Per oltre un centinaio di anni, l’esame istologico dei tessuti è stato il gold standard per la diagnosi medica perché l’istologia permette tutti i tipi di cellule in ogni tessuto per essere identificato e caratterizzato. Il nostro laboratorio sta lavorando attivamente per fare progressi tecnologici in raggi x micro-tomografia computerizzata (micro-CT) che porterà il potere diagnostico dell’istologia per lo studio dei volumi di tessuto completo al cellulare ad alta risoluzione (cioè., raggi x Modalità di Histo-Tomography). A questo scopo abbiamo apportato miglioramenti mirati alla pipeline di preparazione del campione. Una chiave di ottimizzazioni e l’obiettivo del presente lavoro, è un metodo semplice per l’incorporamento rigida di campioni di scala millimetrata fisso e macchiato. Molti dei metodi pubblicati per esempio immobilizzazione e formazione immagine correlativa di micro-CT si basano sul posizionamento dei campioni in paraffina, agarosio o liquidi come alcool. Il nostro approccio si estende questo lavoro con procedure personalizzate e il design di un apparato stampabile 3-dimensionale per incorporare i campioni in una resina acrilica direttamente in polyimide tubazione, che è relativamente trasparente ai raggi x. Sono descritte le procedure di preparazione del campione per i campioni da 0,5 a 10 mm di diametro, che sarebbe adatto per larve di zebrafish intero e novellame o altri animali e campioni di tessuto di dimensioni simili. Come prova di concetto, noi abbiamo incorporato i campioni da Danio, Drosophila, Daphniae un embrione di topo; immagini rappresentative da scansioni 3-dimensionale per tre di questi campioni sono mostrati. D’importanza, la nostra metodologia conduce a molteplici vantaggi, tra cui immobilizzazione rigida, conservazione a lungo termine delle risorse faticosamente creato e la capacità di interrogare nuovamente campioni.
Introduction
Fenotipi sono tratti osservabili di un organismo che rappresentano le conseguenze delle interazioni uniche tra il suo patrimonio genetico e l’ambiente. Queste caratteristiche possono includere proprietà comportamentali, biochimici, morfologici, inerente allo sviluppo, o fisiologiche. Cosa importante, differenze nei tratti tra organismi wild type e mutanti genetici possono fornire informazioni chiave sui meccanismi e le funzioni dei geni interessati. Per quanto riguarda la morfologia, l’istopatologia è il gold standard per la valutazione di fenotipi a livello cellulare ma soffre di manufatti meccanici e non permette accurate analisi volumetrica quantitativa1. Il nostro laboratorio è motivato a superare le barriere per l’applicazione del potere diagnostico dell’istologia a volumi di tessuto completo a risoluzione di submicron.
Un sondaggio di tecnologie disponibili suggerisce che la formazione immagine ai raggi x micro-computato tomografia (micro-CT) può fornire funzionalità ideale necessaria per l’istologia scala millimetrata intero-animale 3-dimensionale (3D). Micro-CT consente la visualizzazione non distruttiva, isotropo, 3D e la capacità di condurre analisi quantitativa del tessuto architettura1,2. Negli ultimi anni, immagini 3D di zebrafish non macchiate e metallo-macchiato dal micro-CT ha guadagnato la trazione crescente ed sono stata utilizzata per analisi volumetrica dei diversi tessuti, compreso il muscolo, denti, ossa e tessuti adiposi3,4 ,5,6,7,8,9,10. Altri organismi modello e campioni di tessuto sono inoltre favorevoli a micro-CT imaging. Per esempio, una pipeline è stato introdotto per quantificare la neuroanatomia mesoscala denso di cervelli di topo imaged via sincrotrone micro-CT11. Allo stesso modo, un protocollo di colorazione eosina-basato ha dimostrato di essere adatto per tessuti molli micro-imaging TC di mouse interi organi12. L’analisi morfometrica delle vertebre di L3 umane non macchiate e la visualizzazione dei polmoni umani argento-macchiate usando micro-CT hanno dimostrato l’utilità di questa tecnologia per umani campioni13,14.
Al fine di attualizzare la grande promessa del micro-CT per fenotipizzazione morfologica completa di piccoli animali intatti e gli esemplari del tessuto, una serie di ostacoli deve essere superati in relazione alla velocità di trasmissione, risoluzione, campo di vista, cella completa colorazione, e conservazione a lungo termine. Mentre ciascuno di questi aspetti è di fondamentale importanza, il focus del presente manoscritto è l’ottimizzazione delle procedure di incasso, con note aggiuntive sull’esempio fissazione e colorazione. Macchiatura di metalli pesanti è utile perché il contrasto inerente tra diversi tessuti molli nelle immagini di micro-CT è basso. La potenza di metallo varie macchie, come il tetrossido di osmio, iodio, acido fosfotungstico (PTA) e gallocyanin-chromalum, per migliorare il contrasto per imaging di micro-CT è stato studiato15,16,17. Acetato di uranile è stato utilizzato anche come agente di contrasto per imaging micro-CT dell’osso e della cartilagine18,19. PTA come usato nel nostro protocollo porta a colorazione coerente di quasi tutti i tessuti e le cellule negli esemplari di zebrafish intero, producendo immagini che sono potenzialmente compatibili con istologia-come studi attraverso volumi completi del tessuto.
Durante l’acquisizione di immagini di micro-CT, proiezione 2-dimensionale (2D) è presa come campione viene ruotato per una frazione di grado e ripetuta fino a che il campione ha completato una rotazione di 180° o 360°, generando una serie di migliaia di proiezioni 2D utilizzate per la ricostruzione del volume 3D20. In questo processo, qualsiasi perturbazione dell’esemplare causerà le proiezioni 2D corrispondente essere fuori allineamento, con conseguente mal ricostruiti volumi 3D. Immobilizzazione del campione è un modo per correggere questo problema e alcune strategie attuali implicano immergendo il campione in alcool o incorporamento in agarosio in provette di polipropilene o micropipetta suggerimenti3,5,15, 16 , 21 , 22. metodi di immersione in liquidi non sono l’ideale perché il movimento del campione durante l’acquisizione delle immagini può verificarsi tra insiemi di imaging, con conseguente spostati ricostruzioni di volumi 3D23. Inoltre, è ben noto che la stabilità fisica dei campioni di tessuto liquido-conservato è povera di scale di tempo di mesi o anni, a seguito di instabilità chimica e all’abrasione superficiale associata con il movimento dei punti di contatto tra il campione e il contenitore parete ( osservazioni personali con campioni di tessuto animale e umano fisso).
Per ridurre il potenziale per il movimento del campione durante la formazione immagine, i campioni possono essere incorporati in agarosio24,25,26, ma questa pratica è associata con il rischio della macchia diffondente in agarosio riducendo così immagine 26il contrasto. Inoltre, preparazioni di liquido o agarosio sono inclini a danni fisici e degradano nel tempo, che li rende inutilizzabili per la conservazione a lungo termine di campione. Abbiamo ragionato che un metodo di immobilizzazione di esempio semplice e potenzialmente di successo potrebbe essere adattato da quello utilizzato per i campioni di microscopia elettronica. Resine polimerizzate come EPON 812 (interrotto e sostituito da incorporare 812) sono comunemente usate per fornire la durezza necessaria per generare sezioni ultrasottili per microscopia elettronica27,28. Infatti, parecchi studi comparativi tra imaging a raggi x e microscopia elettronica hanno dimostrato che i campioni incorporati in resina possono essere ripreso da raggi x microscopia29,30. Tuttavia, alcune delle pratiche standard di microscopia elettronica non si traducono direttamente a micro-CT imaging. Ad esempio, micro-CT imaging di campioni con quadrati resina bordi dei blocchi in resina tipica e campioni tagliati da quei blocchi è associato con artefatti di diffrazione di bordo che possono interferire con la formazione immagine. Lisciando i bordi di resina, quando possibile, è laboriosa e richiede tempo.
Mentre una varietà di resine plastiche incorporamento sono impiegati in microscopia elettronica, l’alta priorità bassa associata con resine più difficile come incorporare 812 ci ha portato a testare gli altri. Abbiamo scelto LR White grazie alla sua bassa viscosità, basso ritiro, bassa tendenza a formare delle bolle durante la polimerizzazione e priorità bassa più bassa. Per creare campioni di bordo libero e per ridurre al minimo la quantità di resina che circondano il campione, abbiamo sviluppato i protocolli per disegnare gli esemplari in resina liquida in tubazione di polyimide prima della polimerizzazione. Polyimide è stato scelto per la sua elevata stabilità termica e alta trasmissione di raggi x in modo che la rimozione del tubo non è necessaria per l’imaging. Infine, abbiamo progettato un adattatore personalizzato micropipetta per il nostro campione incorporamento tecnica al fine di tenere il tubo e impedire la contaminazione di Micropipette in modo affidabile. L’adattatore può essere stampato da un file di immagine di CAD 3D. Presi insieme, l’obiettivo dei metodi di preparazione del campione qui presentato è di rendere l’incorporamento di piccoli campioni più semplici, realizzare enhanced colorazione di contrasto, immobilizzazione rigida e archiviazione a lungo termine degli esemplari scala millimetrata intatto.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato per immobilizzazione rigida della scala millimetrata fisso e macchiato esemplari (0,5 fino a 2,5 mm di diametro) per micro-CT imaging. Dato il rapido progresso della tecnologia di micro-CT per quanto riguarda la risoluzione e la velocità, un metodo di conservazione del campione permanente con re-imaging delle funzionalità è altamente desiderabile. Tradizionalmente, la densa resina incorporamento sono comunemente usati in microscopia elettronica per fornire il supporto strutturale per tagliare sezioni ultrasottili e minimizzare i danni alla provetta. Il nostro metodo adattato suo uso per immobilizzazione rigida durante la formazione immagine non-distruttivo. Per ridurre al minimo gli artefatti imaging dalla presenza di resina in eccesso, abbiamo implementato l’utilizzo di tubazione di polyimide trasparente ai raggi x per creare campioni di turno senza bordi e di limitare il volume di resina intorno al campione.
Risultato ottimale della procedura incorporamento è condizionato all’attenta esecuzione di diversi passaggi critici e attenzione per l’integrità del campione durante tutta la procedura. Infatti, danneggiare l’esemplare si tradurrà in un’immagine finale compromessa indipendentemente dal successo di esecuzione dell’imaging. Poiché agghiacciante contribuisce a una diminuzione delle risposte di dolore e tessuto unfixed degrada più rapidamente a temperature più elevate, usiamo i reagenti pre-refrigerati. Esemplari di grandi dimensioni potrebbero essere necessario essere tagliato per permettere l’entrata di fissativo nella parte interna dell’esemplare, affinché gli organi interni come fegato, pancreas e intestino sono completamente fissi. Tessuti non fissati deteriorano e perdono l’integrità strutturale, distruggendo la struttura biologica. Un altro passo fondamentale è quello di mantenere il campione nel suo allineamento naturale. Di conseguenza, sosteniamo per l’uso di contenitori a fondo piatto, che usiamo in tutta la procedura e sono particolarmente importante durante la fissazione. Fissaggio in polipropilene tubi o tubi conici che di solito hanno un fondo a forma di V dovrebbero essere evitati perché possono causare allungati campioni di piegarsi, che distorce la naturale morfologia dell’esemplare. Inoltre, per ridurre al minimo l’uso della resina, il diametro interno della tubazione di polyimide è solo leggermente più grande rispetto alla larghezza dell’esemplare. Flessione dell’esemplare può anche provocare danni al provino, che entra il tubo. Si raccomanda inoltre di trasferire il campione nel tubo in modo naturale per evitare dannosi estremità. La disidratazione corretta è un altro passo fondamentale. Questa operazione viene eseguita con piccoli incrementi di aumento delle concentrazioni di EtOH per lentamente sostituire l’acqua con EtOH, che è più miscibile con la resina. Grandi aumenti nella concentrazione di EtOH sono associati con il restringimento del tessuto e possono essere migliorati da ulteriori incrementi di EtOH incubazione per rendere la transizione più graduale. Infine, per ridurre al minimo il movimento dell’esemplare o sacche d’aria, se presenti, i campioni vengono posti orizzontalmente durante la polimerizzazione della resina (fine del Day 4). Sacche d’aria o sigillante accanto l’esemplare causa artefatti ottici con imaging a raggi x associata con diffrazione a bordo, riducendo la qualità dell’immagine.
Per quanto riguarda eventuali modifiche al protocollo, altri che utilizza resine e metallo macchie possono essere utilizzate al posto di acrilico bianco di LR e PTA, rispettivamente. Embed812, resina epossidica, comunemente usata in microscopia elettronica, è altamente viscoso, più difficile il trasferimento, può causare la distorsione degli esemplari ed è associato con sfondo superiore rispetto a Resine metacrilato acrilico o glicole. Mentre JB4 Plus, un metacrilato di glicole, è meno viscoso di EMbed812 e ha priorità bassa più bassa, casuale formazione di sacche d’aria appaiono frequentemente in prossimità del campione. Come accennato, sacche d’aria degradare la qualità dell’immagine e sono particolarmente problematici per preziosi campioni. Vale la pena notare che Technovit 7100, un’altra in metacrilato di glicole, interferisce con la colorazione PTA conseguente scarso contrasto nell’immagine finale. Comparativamente, LR bianco acrilico ha acqua-come viscosità, basso fondo e non interferisce con la macchiatura di PTA. Nelle nostre mani, il tasso di successo di incorporamento in LR bianco senza bolle d’aria o di danni del campione è supera al 95%. Per questi motivi, sosteniamo il suo uso come la resina di incorporamento per tessuto micro-CT. Per quanto riguarda le macchie, il risultato di metallo varie macchie come il tetrossido di osmio, iodio, e PTA in micro-CT imaging è stata confrontata e discusso altrove15,16,17 e non rientra nell’ambito di questo manoscritto.
La dimensione del campione è una limitazione importante alla nostra attuale protocollo. Poiché ci avvaliamo di aspirazione per trasferire gli esemplari nel tubo, la capacità di vedere l’esemplare è fondamentale per l’orientamento e garantire che è davvero nelle tubazioni. Di conseguenza, sub-millimetrica campioni come Tardigrada (cioè., orsi di acqua) sono estremamente difficili da incorporare perché essi richiedono l’uso di un microscopio per essere visualizzati. Una volta applicata la aspirazione, preparati microscopici sono facilmente persi dal piano focale e diventano impegnativi a riscoprire, che lo rende difficile determinare se troppo lontano che passati alla fine allegata della tubazione. I più grandi campioni, come embrioni di topo, (3-10 mm) possono essere incorporati con lievi modifiche al protocollo di incorporamento (Figura 4). In particolare, la tubazione di polyimide è stata riempita con 1/3 di resina liquida, che era polimerizzata prima dell’inclusione. Il campione fisso e macchiato è stato messo in cima la resina pre-polimerizzata. Il tubo è stato poi completamente riempito di resina non polimerizzata e seguito da una seconda polimerizzazione.
Il significato del nostro protocollo di incorporamento è molteplice. Rigidamente immobilizzato intero animale o tessuto esemplari sono desiderabili per motivi tra cui: (1) creazione di repository a lungo termine di campioni che sono difficili da generare o preparare; (2) ri-acquisizione dei dati; (3) attivazione seriale imaging utilizzando più modalità di imaging; e (4) fornendo gli standard di calibrazione e sviluppo tecnologico. Campioni preparati con la nostra procedura di incasso sono racchiusi in resina solida che è resistente contro danni e pertanto possono essere facilmente memorizzati forse tempo indeterminato. Archiviazione a lungo termine è particolarmente utile per gli esemplari rari o faticosamente generati come quelli associati a progetti di fenomeno. Ulteriormente, nel caso in cui i dati digitali vengono persi, i dati possono essere generati da campione originale. La capacità di re-imaging per un lungo periodo di tempo potenzialmente permette lo stesso campione essere interrogati con più avanzate modalità di formazione immagine in futuro. Dal momento che i campioni sono fisicamente stabili tra istanze imaging, immagini sono acquisite dallo stesso esemplare nello stesso orientamento, facilitando la registrazione tra insiemi di dati precedenti e successive. Ad esempio, un’immagine a bassa risoluzione può consentire solo segmentazione dei tessuti in una larva di pesce zebra. La larva stessa più tardi può essere ri-imaged a risoluzione superiore in modo che più dettagliate analisi computazionali al cellulare ad alta risoluzione. Questa funzionalità per un confronto diretto tra le scansioni registrati suggerisce campioni resina-incastonati come un potenziale standard per lo sviluppo della tecnologia di micro-CT. Gli effetti di qualsiasi alterazione per il metodo di imaging possono essere valutati da imaging dello stesso campione in modo che tutte le variabili in fase di preparazione dei campione sono controllate. Infine, un campione standard incorporato resina utilizzabile per la calibrazione dello strumento per verificare la coerenza di imaging.
Il nostro lavoro precedente esame di istologia pesce mutante e malato ha mostrato che cellulare ad alta risoluzione permette la rilevazione di anomalie sottili nella struttura del tessuto che sono trascurati in esame lordo utilizzando il microscopio per dissezione36, o una bassa potenza microscopio stereo. Vogliamo espandere la nostra analisi ad alta risoluzione ai campioni umani. Le larve di zebrafish, che comprendono il soggetto primario del nostro lavoro di sviluppo, sono simili alle biopsie umane nella loro fragilità, eterogeneità cellulare e intercellulare del tessuto, dimensioni (1-3 mm di diametro) e forma allungata. Basato sulla nostra vasta esperienza con zebrafish e altri lavori mostrando che micro-CT con successo macchiato e scansionato il tessuto umano, anche se a bassa risoluzione37, ci aspettiamo che i nostri approcci per portare valore aggiunto per l’imaging e l’analisi delle biopsie dell’ago. Abbiamo stimato che il montaggio di un kit sufficiente per una preparazione di fino a 20 campioni della stessa condizione essere potenzialmente meno di 30 USD. I campioni preparati dal nostro metodo incorporamento sono resistente ai danni fisici e quindi facile da trasportare. Il basso costo e facilità di trasporto suggeriscono la possibilità di raccolta di campioni da tutto il mondo, in particolare le zone in cui imaging cellulare ad alta risoluzione con micro-CT non è facilmente accessibile. La nostra visione è per il file digitali ad alta risoluzione delle biopsie da agoaspirato (che vanno da 0,1 a diversi terabyte) per abilitare la creazione di un atlante digitale dei tessuti umani e allo stesso tempo consentire ai ricercatori di perfezionare e migliorare il pipeline di analisi corrente per localizzazione e caratterizzazione quantitativa dell’architettura cellulare e tessutale nel contesto 3D dei tessuti analizzati.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Roland Myers per gentilmente fornire i protocolli TEM originali. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. John Colbourne per fornire il campione di Daphnia , Dr. Santhosh Girirajan per aver fornito l’esemplare di Drosophila e Dr. Fadia Kamal per fornire l’embrione di topo. I ricercatori riconoscono finanziamento da NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), i laboratori di Gittlen di Jake per ricerca sul cancro e da pilota premio finanziamenti dal PSU Huck istituti delle scienze della vita e dell’Istituto per CyberScience.
Materials
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
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