Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

In diesem Manuskript präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für starre Immobilisierung fester und voller Flecken Millimeter-Skala (0,5 bis 2,5 mm Durchmesser) Proben für die Mikro-CT-Bildgebung. Angesichts der schnellen Vormarsch der Mikro-CT-Technologie in Bezug auf Auflösung und Geschwindigkeit, ist eine Methode der permanenten Probe Konservierung mit Re-imaging Funktionen höchst wünschenswert. Traditionell, dichten Einbettung Harz allgemein dienen in der Elektronenmikroskopie zur Strukturförderung zu ultradünnen Abschnitte schneiden und den Schaden auf die Probe zu minimieren. Unsere Methode angepasst seine Verwendung für starre Ruhigstellung während nicht-destruktive Bildbearbeitung. Um die bildgebenden Artefakte aus dem Vorhandensein von überschüssiges Harz zu minimieren, haben wir die Verwendung von x-ray transparent Polyimid Schläuche Runde Proben ohne Kanten zu erstellen, und das Volumen der Harz um die Probe beschränken implementiert.

Optimales Ergebnis des Verfahrens einbetten ist sorgfältige Ausführung mehrere wichtige Schritte und Liebe zum Beispiel Integrität während des Verfahrens abhängig. In der Tat, Beschädigung der Probekörpers eine kompromittierte Endbild unabhängig vom Erfolg der Ausführung der Bildgebung führen. Da kühlen zu einer Verminderung der Schmerz Antworten trägt und fixierten Gewebe verschlechtert sich bei höheren Temperaturen schneller, verwenden wir vorgekühlt Reagenzien. Große Exemplare müssen geschnitten werden, um den Eintrag Fixativ in das Innere der Probe zu ermöglichen, so dass innere Organe wie Leber, Bauchspeicheldrüse und Darm vollständig behoben sind. Fixierten Gewebe verschlechtern und strukturelle Integrität, Zerstörung der biologischen Struktur zu verlieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist, die Probe in seiner natürlichen Ausrichtung beizubehalten. Daher setzen wir uns für die Verwendung von flachen Behälter, die wir im gesamten Verfahren und sind besonders wichtig bei Fixierung verwenden. Fixierung in Polypropylen Röhrchen oder konische Rohre, die in der Regel einen v-förmigen Boden sollte vermieden werden da sie längliche Proben zu biegen, verursachen können die verzerrt der natürliche Morphologie der Probe. Darüber hinaus ist der Innendurchmesser des Polyimid-Schlauch um die Verwendung von Harz zu minimieren, nur etwas größer als die Breite der Probe. Biegen der Probe kann auch Schaden der Probe führen beim Eintritt in die Röhre. Es wird auch empfohlen, die Probe in den Schlauch auf natürliche Weise zur Vermeidung von schädlicher Extremitäten nach vorne übertragen. Ordnungsgemäße Entwässerung ist ein weiterer entscheidender Schritt. Dies geschieht mit kleinen Schritten EtOH Konzentrationen langsam ersetzt Wasser mit EtOH, das ist mehr mischbar mit dem Harz zu erhöhen. Starke Anstieg der Konzentration von EtOH Gewebe schrumpfen zugeordnet sind und durch zusätzlichen Schritten von EtOH Inkubation für die Umstellung schrittweise gelindert werden können. Zur Minimierung der Bewegung der Probe oder Lufteinschlüsse, wenn es welche gibt, sind schließlich die Proben während der Harz-Polymerisation (Ende 4. Tag) horizontal platziert. Lufteinschlüsse oder Versiegelung neben der Probe führt zu optischen Artefakte mit Röntgenbildgebung Rand Beugung, Verringerung der Bildqualität zugeordnet.

In Bezug auf eventuelle Änderungen des Protokolls, andere Einbetten von Harzen und Metall Flecken können anstelle von LR White Acryl und PTA, bzw. verwendet werden. Embed812, ein Epoxidharz, allgemein verwendet in der Elektronenmikroskopie, hochviskosen, schwieriger zu übertragen ist, kann dazu führen, dass die Verzerrung der Exemplare und ist verbunden mit höheren Hintergrund als Acryl- oder Glykol Methacrylat-Harze. Während JB4 Plus ein Glykol-Methacrylat ist dünnflüssiger als EMbed812 und untere Hintergrund hat, zufällige Entstehung von Lufteinschlüssen erscheinen häufig in der Nähe der Probe. Wie bereits erwähnt, Lufteinschlüsse verschlechtern die Bildqualität und sind besonders problematisch für wertvollen Proben. Es ist erwähnenswert, dass Technovit 7100, ein weiterer Glykol Methacrylat mit PTA Färbung, stört was zu schlechten Kontrast im endgültigen Bild. Vergleichsweise, LR White Acryl hat Wasser-wie Viskosität, niedrige Hintergrund und stört nicht mit PTA zu beflecken. In unseren Händen ist die Erfolgsquote bei der Einbettung in LR weiß ohne Probe Schaden oder Luftblasen mehr als 95 %. Aus diesen Gründen befürworten wir seine Verwendung als das Einbetten von Harz für Gewebe Mikro-CT. In Bezug auf Flecken die Ergebnisse der verschiedenen Metall Flecken wie Osmium ausgefällt, Jod, und PTA in Mikro-CT-Bildgebung wurde verglichen und diskutiert an anderer Stelle^15,16,17 und ist nicht in den Anwendungsbereich dieser Manuskript.

Die Größe der Stichprobe ist eine große Einschränkung unserer aktuellen Protokolls. Da wir saugen beschäftigen, Proben in den Schlauch zu übertragen, ist die Fähigkeit zu sehen, die Probe für Orientierung und die Gewährleistung, die es in der Tat im Schlauch ist von entscheidender Bedeutung. Infolgedessen Submillimeter Proben wie Bärtierchen (i.e., Bärtierchen) sind extrem schwer zu integrieren, weil sie erfordern den Einsatz ein Mikroskops visualisiert werden. Sobald Absaugung angewendet wird, mikroskopische Präparate sind leicht von der Fokalebene verloren und werden schwierig zu entdecken, macht es schwierig, festzustellen, ob sie die angefügte Ende des Schlauches zu weit durchlaufen. Größere Proben, wie mäuseembryonen, (3-10 mm) können mit geringfügigen Änderungen zum Einbetten von Protokoll (Abbildung 4) eingebettet werden. Insbesondere wurde der Polyimid-Schlauch auf 1/3 mit Flüssigharz, die vor dem Einbetten polymerisiert war gefüllt. Die feste und gefärbte Probe wurde auf das Pre polymerisierten Harz platziert. Das Rohr war dann voll gefüllt mit UN-polymerisierten Harz und gefolgt von einem zweiten Polymerisation.

Die Bedeutung unserer einbetten Protokoll ist vielfältig. Starr immobilisierte ganze Tier oder Gewebe Proben aus Gründen einschließlich wünschenswert sind: (1) Schaffung von langfristigen Repositories von Proben, die schwer zu generieren oder vorzubereiten; (2) die Wiedererlangung von Daten; (3) aktivieren serielle Bildgebung mit mehreren bildgebender Verfahren; und (4) Bereitstellung von Standards für die Kalibrierung und Technologieentwicklung. Proben mit unserem einbetten Verfahren sind eingehüllt in festen Harz, das widerstandsfähig gegen Beschädigungen und können daher leicht gespeichert werden vielleicht auf unbestimmte Zeit. Langfristiger Lagerung eignet sich besonders für seltene oder mühsam erzeugte Exemplare wie die Phenome Projekten zugeordnet. Weiter, den Fall, dass die digitalen Daten verloren gegangen sind, können die Daten aus der ursprünglichen Probe generiert werden. Die Fähigkeit des Re-imaging über einen langen Zeitraum hinweg potenziell ermöglicht die gleiche Probe mit verhört werden erweiterte bildgebende Modalitäten in der Zukunft. Da die Proben körperlich stabil zwischen bildgebenden Instanzen sind, sind Bilder vom gleichen Muster in der gleichen Ausrichtung, Erleichterung der Registrierung zwischen früheren und späteren Datensätzen erworben. Beispielsweise kann eine Bild mit niedriger Auflösung nur Segmentierung der Gewebe in einem Zebrafisch-Larven. Die gleichen Larve kann später mit höherer Auflösung neu aufgespielt werden, so dass numerische Analysen mit zellulären Auflösung detaillierte. Diese Funktion zum direkten Vergleich zwischen den registrierten Scans schlägt Harz eingebettete Proben als möglicher standard für die Entwicklung von Mikro-CT. Die Auswirkungen der Änderungen auf das bildgebende Verfahren können beurteilt werden, von der gleichen Probe imaging, so dass alle Variablen in der Probe Vorbereitungsschritt gesteuert werden. Schließlich kann eine Harz eingebettet Standardprobe für Kalibrierung verwendet werden, für Konsistenz der Bildgebung zu testen.

Unsere bisherige Arbeit mutierten und erkrankten Fische Histologie Untersuchung zeigte, dass zelluläre Auflösung ermöglicht subtile Auffälligkeiten in der Gewebestruktur, die in grober Untersuchung mittels der sezierenden Mikroskop³⁶oder ein Niederleistungs übersehen werden Stereo-Mikroskop. Wir möchten unsere hochauflösenden Analysen auf humanen Proben zu erweitern. Zebrafisch-Larven, die das primäre Thema unserer Entwicklungsarbeit umfassen, sind ähnlich wie menschliche Nadel Biopsien in ihrer Zerbrechlichkeit, zellulären und interzelluläre Gewebe Heterogenität, Größe (1-3 mm Durchmesser) und längliche Form. Basierend auf unserer langjährigen Erfahrung mit Zebrafisch und andere arbeiten, die zeigen, dass Mikro-CT erfolgreich gebeizt und gescannt von menschlichem Gewebe, wenn auch bei niedriger Auflösung³⁷, erwarten wir unsere Ansätze zur Darstellung und Analyse der Nadel Biopsien Mehrwert verleihen. Wir haben geschätzt, dass die Montage ein Set reicht für eine Vorbereitung von bis zu 20 Proben der gleichen Bedingung, möglicherweise weniger als 30 US-Dollar. Die Proben vorbereitet durch unsere Einbettungs-Methode sind resistent gegen physischen Schaden und daher leicht zu transportieren. Die kostengünstigen und einfachen Transport empfehlen die Möglichkeit der Entnahme von Proben aus auf der ganzen Welt, insbesondere die Gebiete in denen zelluläre Auflösung Bildgebung mit Mikro-CT nicht leicht zugänglich ist. Unsere Vision ist, dass digitale Dateien mit hoher Auflösung der Nadel Biopsien (von 0,1 bis hin zu mehreren Terabyte) ermöglichen die Erstellung eines digitalen Atlas des menschlichen Geweben, und zur gleichen Zeit lassen die Forscher zu verfeinern und zu verbessern aktuelle Analyse Pipelines für Lokalisierung und quantitative Charakterisierung der zellulären und Gewebe Architektur 3D im Rahmen des Gewebes gescannt.