Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus
Summary
Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.
Abstract
Medición en tiempo real de las oscilaciones en el nivel unicelular es importante descubrir los mecanismos de los relojes biológicos. Aunque extractos bulto preparados de huevos de Xenopus laevis han sido poderosos en disección redes bioquímicas subyacentes a la progresión del ciclo celular, su medición promedio del conjunto por lo general conduce a una oscilación amortiguada, a pesar de cada uno cada oscilador está sostenida. Esto es debido a la dificultad de sincronización perfecta entre osciladores individuales en los sistemas biológicos ruidosos. Para recuperar la dinámica unicelular del oscilador, hemos desarrollado un sistema de célula artificial basada en gotas que puede reconstituir ciclos mitóticos en compartimentos de la célula-como encapsular ciclismo extractos citoplásmicos de los huevos de Xenopus laevis . Estas células sólo citoplasmáticas simples exhiben oscilaciones sostenidas durante más de 30 ciclos. Para construir más complicadas las células con los núcleos, agregamos demembranated la cromatina espermática para activar núcleos uno mismo-montaje en el sistema. Observamos una progresión periódica de cromosoma condensación/decondensation y núcleos envuelven descomposición/reforma, como en las células reales. Esto indica que el oscilador mitotic funcione fielmente para conducir varios eventos mitóticos aguas abajo. Simultáneamente realiza un seguimiento la dinámica del oscilador mitotic y procesos posteriores en gotas individuales utilizando microscopía de fluorescencia Time-lapse de multicanal. El sistema de ciclo celular artificial proporciona un marco de alto rendimiento para la manipulación cuantitativa y análisis de oscilaciones mitóticas con resolución unicelular, que probablemente proporciona penetraciones importantes en la maquinaria reguladora y las funciones de el reloj.
Introduction
Citoplásmicos extractos preparados a partir de huevos de Xenopus laevis representan uno de los modelos más predominantes para el estudio bioquímico de los ciclos celulares, dado el gran volumen de ovocitos, la progresión del ciclo celular rápida y la capacidad de reconstituir eventos mitóticos en vitro1,2. Este sistema ha permitido el descubrimiento inicial y caracterización mecanicista de los reguladores de ciclo celular esencial como factor promotor de maduración (MPF) así como procesos mitotic posteriores incluyendo huso Asamblea y cromosoma segregación1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Los extractos de huevos de Xenopus también se han utilizado para la disección detallada de las redes reguladoras del ciclo celular reloj8,12,13,14 y para los estudios de los daños en el ADN /Replication de control15 y huso mitotic Asamblea checkpoint16,17,18.
Estos estudios de los ciclos celulares utilizando los extractos de huevos de Xenopus se han basado principalmente en mediciones masivas. Sin embargo, ensayos de reacción a granel convencional no pueden mímico comportamientos de celular real, dados una discrepancia importante en sus dimensiones y compartimentación subcelular espacial de las moléculas de reacción. Por otra parte, mediciones masivas de actividades mitotic son propensas a dar un número limitado de ciclos antes de amortiguación rápida8. Estas desventajas de reacciones a granel han impedido que el extracto de sistema para proporcionar más comprensión de funciones y propiedades dinámicas complejas de reloj. Estudios recientes han encapsulado citostáticos sin células factor detenido (CFS) Xenopus extractos19,20 en compartimentos de celular-como definido por el tamaño, que han ayudado a dilucidar cómo tamaño de husillo es modulada por el volumen citoplásmico. Sin embargo, este sistema in vitro es detenido en metafase de meiosis II por la acción del factor citostático1, y un sistema capaz de oscilaciones sostenidas a largo plazo en el nivel unicelular es necesaria investigación adicional del ciclo celular oscilador.
Para estudiar las oscilaciones del ciclo celular con una sola célula resolución, hemos desarrollado una escala celular, sistema de alto rendimiento para la reconstitución y la medida simultánea de múltiples procesos oscilatorios mitotic autosostenidos en microemulsión individual gotas. En este detallado video protocolo, demostramos la creación del sistema de oscilación mitotic artificial encapsulando ciclismo citoplasma de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones de tamaños que van desde 10 a 300 μm. En este sistema, fueron mitotic oscilaciones como condensación del cromosoma y la condensación, ruptura de la envoltura nuclear y reforma y la degradación y síntesis de sustratos de la anafase (p. ej., securin-mCherry en este protocolo) reconstituido con éxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado un nuevo método para el desarrollo de un sistema celular artificial de alto rendimiento permite vitro en reconstitución y seguimiento a largo plazo de las oscilaciones de ciclo celular autosuficiente a nivel unicelular. Hay varios pasos fundamentales que hacen que este método exitoso. Huevos de Xenopus de primera, recién exprimidos con una buena calidad, en comparación con huevos establecidas, tienden a producir extractos con actividad de oscilación de mayor duración. En segundo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Madeleine Lu para construir mCherry securin plásmido, vuelta hombre Lee, Kenneth Ho y Allen P Liu para los debates sobre la generación de gotas, Jeremy B. Chang y James E. Ferrell Jr para proporcionar la que construcción de GFP-NLS. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (carrera temprana Grant #1553031), los institutos nacionales de salud (MIRA #GM119688) y una beca de investigación de Sloan.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
