La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae
Summary
Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.
Abstract
Misura in tempo reale delle oscillazioni a livello di singola cellula è importante scoprire i meccanismi di orologi biologici. Anche se alla rinfusa gli estratti preparati con uova di Xenopus laevis di sono stati potenti in reti biochimiche che sono alla base della progressione del ciclo cellulare di dissezione, loro misura media ensemble in genere porta ad un’oscillazione smorzata, nonostante ciascuno oscillatore individuale essendo sostenuta. Ciò è dovuto la difficoltà di sincronizzazione perfetta tra singoli oscillatori in sistemi biologici rumorosi. Per recuperare la cella singola dinamica dell’oscillatore, abbiamo sviluppato un sistema di cellula artificiale basata su goccia che può ricostituire mitotic cicli nei compartimenti di cellula-come incapsulare ciclismo estratti citoplasmatici di uova di Xenopus laevis . Queste semplici cellule solo citoplasmatici presentano oscillazioni sostenute per oltre 30 cicli. Per costruire più complicate cellule con i nuclei, abbiamo aggiunto della cromatina di sperma demembranated per attivare l’auto-assemblaggio nuclei nel sistema. Abbiamo osservato una progressione periodica del cromosoma condensazione/decondensazione e nuclei avvolgono ripartizione/riforma, come nelle celle reali. Questo indica che l’oscillatore mitotica funzioni fedelmente per guidare più a valle eventi mitotic. Contemporaneamente abbiamo rintracciato la dinamica dei processi a valle in goccioline individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse multi-canale e oscillatore mitotica. Il sistema di ciclo cellulare artificiale fornisce un framework di alto-rendimento per manipolazione quantitativa e l’analisi delle oscillazioni mitotiche con cella singola ad alta risoluzione, che probabilmente fornisce importanti intuizioni la regolamentazione macchine e funzioni di l’orologio.
Introduction
Estratti citoplasmatici preparati con uova di Xenopus laevis di rappresentano uno dei modelli più predominanti per lo studio biochimico dei cicli cellulari, dato il grande volume di ovociti, la progressione del ciclo cellulare rapida e la capacità di ricostituzione eventi mitotic in vitro1,2. Questo sistema ha permesso la scoperta iniziale e caratterizzazione meccanicistico di regolatori del ciclo cellulare essenziale come fattore di promozione di maturazione (MPF) così come i processi mitotici a valle tra cui spindle assembly e cromosoma segregazione1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Gli estratti di uovo di Xenopus sono stati utilizzati anche per la dissezione dettagliata delle reti regolatori del ciclo cellulare orologio8,12,13,14 e per gli studi del danno del DNA /Replication checkpoint15 e il fuso mitotico Assemblea checkpoint16,17,18.
Questi studi dei cicli cellulari usando gli estratti di uovo di Xenopus sono principalmente basati su misurazioni di massa. Tuttavia, analisi di reazione di massa convenzionale non possono imitare i comportamenti reali delle cellule, dati una discrepanza di maggiore dimensioni e subcellulare compartimentalizzazione spaziale delle molecole di reazione. Inoltre, misurazioni di massa di attività mitotica sono inclini a dare un numero limitato di cicli prima di smorzamento rapidamente8. Questi svantaggi delle reazioni di massa hanno impedito il sistema estratto per fornire ulteriore comprensione delle proprietà dinamiche complesse orologio e funzioni. Studi recenti hanno incapsulato senza cellula citostatico fattore-arrestato (CSF) Xenopus estrae19,20 in dimensione definita cellula-come compartimenti, che hanno contribuito a delucidare come dimensione del mandrino è modulata dalla volume citoplasmatico. Tuttavia, questo sistema in vitro è arrestato alla metafase della meiosi II dall’azione del fattore citostatico1, ed è necessario un sistema capace di oscillazioni sostenute a lungo termine a livello di singola cellula per ulteriori indagini del ciclo cellulare oscillatore.
Per studiare le oscillazioni del ciclo cellulare con cella singola risoluzione, abbiamo sviluppato una cella-scala, sistema ad alta produttività per la ricostituzione e la misura simultanea di più processi oscillatori mitotici autogestiti in microemulsione individuo goccioline. In questo protocollo dettagliato dei video, dimostriamo la creazione del sistema artificiale oscillazione mitotica incapsulando ciclismo citoplasma di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di dimensioni che vanno da 10 a 300 µm. In questo sistema, sono stati mitotiche oscillazioni tra cui condensazione cromosomica e de-condensazione, ripartizione busta nucleare e riforma e la degradazione e sintesi dei substrati anafase (ad es., securin-mCherry in questo protocollo) ricostituito con successo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema di alto-rendimento cellula artificiale che consente in vitro ricostituzione e il monitoraggio a lungo termine delle oscillazioni di ciclo cellulare auto-sostenuta a livello di singola cellula. Ci sono diversi passaggi critici che rendono questo metodo successo. Uova di Xenopus in primo luogo, appena spremute con una buona qualità, rispetto alle uova deposte, tendono a produrre estratti con attività di più lunga durata di oscillazione. I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Madeleine Lu per la costruzione del plasmide securin-mCherry, Lap Man Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu per una discussione sulla generazione della gocciolina, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr per la fornitura di CHE GFP-NLS costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (inizio carriera Grant n. 1553031), il National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e un assegno di ricerca di Sloan.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
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