Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten
Summary
Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.
Abstract
Real-time meting van trillingen op de eencellige niveau is belangrijk om te ontdekken de mechanismen van biologische klokken. Hoewel bulk extracten, bereid uit Xenopus laevis eieren krachtig geweest in de ontrafeling van biochemische netwerken ten grondslag liggen aan de celcyclus, leidt hun gemiddelde meting van ensemble meestal tot een gedempte trilling, ondanks elk individuele oscillator wordt opgelopen. Dit is te wijten aan de moeilijkheid van perfecte synchronisatie tussen individuele oscillatoren in lawaaierige biologische systemen. Om op te halen de eencellige dynamiek van de oscillator, ontwikkelden we een kunstmatige cel druppel-gebaseerd systeem dat mitotische cycli in cel-achtige compartimenten encapsulating fietsen cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis eieren kan reconstrueren. Deze eenvoudige cytoplasmatische-alleen cellen vertonen aanhoudende trillingen voor meer dan 30 cycli. Wij toegevoegd om te bouwen ingewikkelder cellen met kernen, demembranated sperma chromatine te activeren de kernen zelf-assemblage in het systeem. We hebben vastgesteld dat een periodieke progressie van chromosoom condensatie/decondensation en kernen omhullen verdeling/Reformatie, zoals in echte cellen. Dit geeft aan dat de mitotische oscillator getrouw functioneert om meerdere downstream mitotische gebeurtenissen. We tegelijk de dynamiek van de mitotische oscillator en downstream processen in afzonderlijke druppels met meerkanaals time-lapse fluorescentie microscopie bijgehouden. Het kunstmatige celcyclus-systeem biedt een high-throughput kader voor kwantitatieve manipulatie en analyse van de mitotische oscillaties met eencellige resolutie, die waarschijnlijk belangrijke inzichten in de regelgevende machines en functies van biedt de klok.
Introduction
Cytoplasmatische extracten, bereid uit Xenopus laevis eieren vertegenwoordigen een van de meest overheersende modellen voor de biochemische studie van cel cycli, gezien de grote hoeveelheid van de eicellen, de snelle celcyclus en het vermogen van de bijenpopulatie mitotische gebeurtenissen in vitro1,2. Dit systeem heeft toegestaan de eerste ontdekking en de mechanistische karakterisering van essentiële celcyclus regelgevers zoals rijping-bevorderende factor (MPF) evenals downstream mitotische processen, met inbegrip van spindel vergadering en chromosoom segregatie1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. De Xenopus ei extracten zijn ook gebruikt voor gedetailleerde dissectie van de regulerende netwerken van de celcyclus klok8,12,13,14 en voor studies van de DNA-schade /Replication checkpoint15 en de mitotische spindel vergadering checkpoint16,17,18.
Deze studies van cel cycli met gebruik van de ei-extracten van Xenopus zijn voornamelijk gebaseerd op metingen van de bulk. Conventionele bulk reactie testen kunnen echter geen echte cel gedrag, krijgen van een belangrijke discrepantie in hun afmetingen en subcellular ruimtelijke opdeling van reactie moleculen nabootsen. Bovendien, bulk metingen van mitotische activiteiten zijn gevoelig voor een beperkt aantal cycli voor snel demping8geven. Deze nadelen van bulk reacties hebben verhinderd het uittreksel systeem om verder inzicht in de complexe klok dynamische eigenschappen en functies. Recente studies hebben ingekapseld cel-vrije cytostatic factor-gearresteerd (CSF) Xenopus 19,20 in grootte gedefinieerde cel-achtige compartimenten, die hebben bijgedragen toelichten hoe de grootte van de spindel wordt gemoduleerd extracten door de cytoplasmatische volume. Echter, dit systeem in vitro is gearresteerd in de metafase van meiose II door de werking van cytostatica factor1, en een systeem dat kan op lange termijn aanhoudende trillingen op het niveau van eencellige nodig is voor verder onderzoek van de celcyclus oscillator.
Studeren celcyclus oscillaties met eencellige resolutie, hebben we ontwikkeld, een cel-schaal, hoge-doorvoer systeem voor reconstitutie en gelijktijdige meting van meerdere zichzelf onderhoudende mitotische oscillerende processen in individuele microemulsion druppels. In dit gedetailleerde video protocol tonen we de oprichting van de kunstmatige mitotische oscillatie systeem door encapsulating fietsen Xenopus laevis ei cytoplasma in Micro van grootte variërend van 10 tot 300 µm. In dit systeem waren de mitotische oscillaties met inbegrip van chromosoom condensatie en ambtshalve condensatie, nucleaire envelop verdeling en Reformatie en de afbraak en synthese van anafase ondergronden (bijvoorbeeld securin-mCherry in dit protocol) met succes aangemaakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dat maakt het mogelijk in vitro reconstitutie en op lange termijn tracking van zichzelf onderhoudende celcyclus-oscillaties op het niveau van eencellige, hebben wij een nieuwe methode voor het ontwikkelen van een systeem met hoge gegevensdoorvoer kunstmatige cel gepresenteerd. Er zijn verschillende kritische stappen die deze methode succesvol te maken. Eerste, versgeperste Xenopus eieren met een goede kwaliteit, in vergelijking met de vastgestelde eieren, de neiging om extracten te produceren met langdu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Madeleine Lu voor de bouw van securin-mCherry plasmide, schoot Man Lee, Kenneth Ho en Allen P Liu voor discussies over druppel generatie, Jeremy B. Chang en James E. Ferrell Jr voor het verstrekken van DAT GFP-NLS construeren. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (vroege carrière Grant #1553031), de National Institutes of Health (MIRA #GM119688), en een Sloan Research Fellowship.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
