Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità
Summary
Questo protocollo descrive un approccio privo di calibrazione per la quantificazione della proteina omo-oligomerizzazione in vitro basati sulla spettroscopia di fluorescenza fluttuazione mediante microscopia a scansione di luce commerciale. Le impostazioni di acquisizione corretta e i metodi di analisi sono mostrati.
Abstract
Numero e la luminosità è una tecnica di spettroscopia (FFS) fluttuazione di fluorescenza privo di calibrazione per la rilevazione di proteine omo-oligomerizzazione. Può essere impiegata utilizzando un microscopio confocale convenzionale dotato di rivelatori digitali. Un protocollo per l’uso della tecnica in vitro è mostrato per mezzo di un caso di utilizzo dove il numero e la luminosità può essere visto per quantificare con precisione lo stato oligomerico di FKBP12F36V mVenus-etichettati prima e dopo l’aggiunta del farmaco dimerizing AP20187. L’importanza dell’utilizzo dei parametri di acquisizione corretta microscopio e i metodi di pre-elaborazione e analisi di dati corretti sono discusse. In particolare, l’importanza della scelta della correzione photobleaching è sollecitata. Questo metodo poco costoso può essere impiegato per studiare le interazioni proteina-proteina in molti contesti biologici.
Introduction
Proteina-proteina interazioni ho n Vitro
Tradizionalmente, cristallografia ed esperimenti di risonanza magnetica nucleare combinati con cRIO-microscopia elettronica (cryoEM) sono le tecnologie scelte di descrivere con precisione l’architettura tridimensionale di proteine e di dedurre la loro funzione di scrutando i dettagli strutturali ad alta risoluzione. Proteine, tuttavia, non sono strutture statiche e possono subire una varietà di cambiamenti conformazionali e vibrazioni nel tempo e nello spazio. Questo è il motivo strutturale informazioni da cristallografici o CryoEM dati devono essere integrata con altre tecniche (ad es., simulazioni di dinamica molecolare e tecniche di singola molecola): la funzione di una proteina è relativo alla sua conformazionali modifiche e interazioni e tale informazione non è presente in una struttura statica. Al fine di sondare per dinamiche intra-molecolari, tecniche basate sulla singola molecola Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) sono molto efficaci1. Questi approcci sono in grado di valutare diverse sottopopolazioni di molecole complesse media. Questo è molto importante, poiché questi cambiamenti sono rapidi e si verificano durante l’acquisizione dei dati (cioè, nanosecondo di seconda fascia).
Due approcci principali sono comunemente impiegati per rilevare e quantificare questi cambiamenti: proteine in soluzione e superficie-immobilizzazione. Per la rilevazione delle interazioni inter-molecolari e in particolare, il processo di dimerizzazione indotta da ligandi, smFRET non è sempre il miglior strumento. Infatti, FRET dipende non solo dalla distanza (â10 nm) ma anche l’orientamento dei due dipoli (donatore e accettore, χ2) e la sovrapposizione dell’emissione donatore con spettri di assorbimento2 del ricettore, ma forse quest’ultima condizione è meno importante purché lo sperimentalista può ha scelto la giusta coppia FRET. Una posizione di particolare svantaggio di smFRET per sondare omo-dimerizzazione proviene l’etichettatura della proteina di interesse: per smFRET etero, dimerizzazione può solo essere rilevato fino al 50% (cioè, etero-FRET sarà solo in grado di rilevare il donatore-accettore e donatore-accettore homo-dimeri ma non donatore-donatore o accettore-accettore, che è l’altro 50% dei dimeri). L’uso della spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) e derivati (FCC, ecc3) per l’accertamento della proteina diffusione costanti e costanti associazione in vitro è un’altra alternativa. Questi approcci non sono in grado di completamente quantificare sia omo-dimerizzazione, come coefficiente di concentrazione e diffusione e il raggio e la diffusione di misure FCS uno di una particella di diffusione sono molto scarsamente dipendenti dal peso molecolare; ad esempio un aumento di 10 volte il peso molecolare comporterà solo un cambiamento di 2.15 piega in diffusione coefficiente4. Nel caso di due colori FCS o FCCS, solo il 50% di homo-dimeri saranno visibili per lo stesso motivo come sopra. Approcci più pratici e quantitativi per rilevare omo-dimerizzazione in vitro e in vivo sono homo-FRET5 numero e luminosità (N & B)6. Dato il fatto che homo-FRET richiede il ripristino di strumentazione specifica del valore di anisotropia (cioè, ottico elementi/analizzatori per recuperare la polarizzazione parallela e perpendicolare), N & B è presentato qui come una tecnica favorevole per rilevare la proteina omo-dimerizzazione e aggregazione. Può essere impiegato sia in vitro che in vivo con un set-up commerciale.
Numero e luminosità
N & B è stato recentemente rivisto7. Tale revisione focalizzata sull’applicazione della tecnica in cellule vive. Vale la pena di riprodurre il formalismo matematico qui come queste equazioni verrà applicato ai dati raccolti in vitro. Innanzitutto, è necessario definire alcuni termini e quantità matematiche:
- Un’entità è un insieme di molecole che sono legati insieme.
- Il ε di luminosità di un’entità è il numero di fotoni che emette per unità di tempo (per telaio).
- n è il numero di entità presenti.
- Per un dato pixel nel corso di una serie di immagini, è che la media intensità e σ2 è la varianza nella sua intensità.
Quindi, con photon-counting rivelatori e supponendo che entità mobile e senza sfondo,
dove N è il numero di apparente e B è la luminosità apparente. Questo si traduce in
De luca et al. 8 hanno mostrato che con apparecchi analogici, uno ha bisogno di tre termini di correzione: il fattore di S, l’ offsetdi sfondo e il rumore di lettura σ02. Quindi, ancora una volta assumendo entità mobile,
dando
Si noti che l’equazione sopra è diverso che dato a Luca et al. 8 e un successivo riesame. 7 in Luca et al. S nel denominatore è stato omesso a causa di un errore di battitura e questo errore è stato riprodotto nella revisione. L’equazione precedente è quella giusta. Istruzioni per la misura S, offset e σ02 – insieme a una spiegazione del loro significato – sono date da Luca et al. 8
Il ε di luminosità è proporzionale allo stato oligomerico delle entità diffondente: ε sarà due volte più grande per dimeri, come nel caso di monomeri, tre volte più grande per trimeri come nel caso di monomeri, due volte più grande per esameri come lo è per trimeri e così via. In questo modo, il ε di luminosità, di misura nessuno può quantificare qualsiasi tipo di multimerization.
Se ci sono una miscela di oligomeri stati presenti, il numero e la luminosità non è in grado di recuperare i singoli Stati oligomerici presenti. Si tratta di una limitazione della tecnica.
Detrend software algoritmo e nandb
Importanza della correzione per photobleaching è stato sottolineato in precedenza9. Photobleaching inevitabilmente si verifica durante gli esperimenti di microscopia in modalità Time-lapse; sia in cellule dal vivo e in vitro. Molti approcci sono stati descritti nella letteratura di correggere per il candeggio7. La tecnica di filtraggio esponenziale con scelta automatica del parametro detrending T è il migliore corrente. È integrato nel software libero, open source nandb9. In effetti, software che richiede all’utente di scegliere manualmente il parametro detrending può portare a risultati non corretti perché questa scelta di parametro sarà probabilmente arbitrario e non corretto. L’algoritmo automatico controlla i dati e determina il parametro appropriato per esso, senza la necessità di intervento utente9. Anche con la migliore scelta del parametro levigante, detrending ha i suoi limiti e funziona bene solo con photobleaching percentuali inferiori al 25%, come mostrato con simulazioni9. È interessante notare che, quando si utilizza la routine di detrending automatica, l’esattezza è tale che si può lavorare con valori di luminosità bassa (anche B < 1.01) e quindi a bassa intensità e ancora essere abbastanza preciso per quantificare omo-dimerizzazione.
Photobleaching provoca anche un altro problema: la presenza di fluorofori photobleached in un complesso multimer. In questo modo ad esempio, un trimero appaiono come un dimero quando una delle tre unità in un trimero è non fluorescenti. Hur e Mueller10 ha mostrato come correggere questo e questa correzione è stata anche sottolineata in una successiva revisione7. Il software di nandb include questa correzione9.
Il FKBP12 F36V sistema
FKBP12F36V è una proteina che naturalmente non oligomerizzazione, ma è noto che dimerizzano sull’aggiunta di droga (colloquialmente conosciuto come il BB dimerizing ligando)11,AP2018712. Questo lo rende un caso di test ideale per numero e luminosità: con FKBP12F36V etichettati, un raddoppio dello stato oligomerico dovrebbe essere osservato con l’aggiunta di BB.
Protocol
Representative Results
Discussion
N & B è una tecnica per rilevare multimerization utilizzando luce commerciale scansione microscopi confocali dotate di rilevatori digitali. Questo approccio è molto attraente rispetto al singolo punto FCS, FCCS e smFRET perché è libero di calibrazione e il calcolo di luminosità è semplice e indipendente di concentrazione6. È di grande importanza, tuttavia, per correggere le fluttuazioni di intensità di imbianchimento e a lungo termine prima di eseguire i calcoli di luminosità<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Wellcome Trust concedere 105278/Z/14/2 a R.N. Il Wellcome Trust Centre for Human Genetics è finanziato dalla Wellcome Trust Core premio 203852/Z/16/2. Lavoro nel gruppo C.S. è supportato da Cancer Research UK (C20724/A14414) e il Consiglio europeo della ricerca nell’ambito dell’Unione europea Horizon 2020 ricerca e innovazione programma Grant 647278.
Materials
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
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