Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité
Summary
Ce protocole décrit une approche sans étalonnage pour quantifier les protéines homo-oligomérisation in vitro basée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation en utilisant la lumière commerciale au microscope à balayage. Les paramètres d’acquisition correcte et les méthodes d’analyse sont affichés.
Abstract
Nombre et l’éclat est une technique de spectroscopie (FFS) de fluctuation de fluorescence exempte d’étalonnage pour la détection des protéines homo-oligomérisation. Il peut être utilisé à l’aide d’un microscope confocal classique muni de détecteurs numériques. Un protocole pour l’utilisation de la technique in vitro est indiqué au moyen d’un cas d’utilisation où le nombre et la luminosité peuvent être vu à quantifier avec précision l’État oligomère de FKBP12F36V marqué au mVenus avant et après l’ajout de la dimérisation drogue AP20187. Les auteurs discutent l’importance d’utiliser les paramètres d’acquisition microscope correcte et les méthodes de prétraitement et l’analyse des données correctes. En particulier, l’importance du choix de la correction de photoblanchiment est soulignée. Cette méthode peu coûteuse peut être employée pour étudier les interactions protéine-protéine dans de nombreux contextes biologiques.
Introduction
Protein-protein Interactions j’ai n Vitro
Traditionnellement, la cristallographie et expériences de résonance magnétique nucléaire combinés avec cryo microscopie électronique (cryoEM) sont les technologies choisies pour décrire avec précision l’architecture tridimensionnelle des protéines et d’en déduire leur fonction par scrutant leurs détails structurels de haute résolution. Protéines, cependant, ne sont pas des structures statiques et peuvent subir une variété de changements de conformation et de vibrations dans le temps et l’espace. C’est pourquoi structurels informations cristallographiques ou CryoEM de données doit être complétée avec d’autres techniques (par exemple, les simulations de dynamique moléculaire et techniques de la molécule unique) : la fonction d’une protéine est liée à sa conformation changements et interactions et cette information n’est pas présent dans une structure statique. Afin de sonder dynamique intra-moléculaire, techniques basées sur la seule molécule Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) sont très efficaces1. Ces approches sont en mesure d’évaluer différentes sous-populations de molécules dans des milieux complexes. C’est très important, car ces changements sont rapides et se produisent lors de l’acquisition des données (c.-à-d. la nanoseconde à la seconde plage).
Deux approches principales sont couramment employées pour détecter et quantifier ces changements : les protéines en solution et surface-immobilisation. Pour la détection de leurs interactions et en particulier, le processus de dimérisation induite par les ligands, smFRET n’est pas toujours le meilleur outil. En effet, frette dépend non seulement de la distance (≈10 nm), mais aussi sur l’orientation des deux dipôles (donneur et accepteur, χ2) et le chevauchement de l’émission du donneur avec les spectres d’absorption de l’accepteur2, mais peut-être cette dernière condition est inférieur important pourvu que l’expérimentateur peut a choisi le bon couple de frette. Un désavantage particulier de smFRET pour sonder les homo-dimérisation vient de l’étiquetage de la protéine d’intérêt : pour smFRET Hétéro, dimérisation ne peut être détectée jusqu’à 50 % (c.-à-d., hétéro-FRET ne sera capable de détecter le donneur-accepteur et donneur-accepteur homo-dimères mais pas donneur donneur ou accepteur d’accepteur, qui est l’autre 50 % des dimères). L’utilisation de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et dérivés (SCCC, etc.3) afin de déterminer les constantes de diffusion de protéine et liaison constantes in vitro est une autre alternative. Ces approches ne sont pas en mesure de quantifier pleinement les homo-dimérisation soit, comme le coefficient de concentration et diffusion et le rayon et la diffusion de mesures FCS celui d’une particule de diffusion dépendent très mal le poids moléculaire ; par exemple une augmentation de 10 fois le poids moléculaire impliquera seulement un changement de 2,15 pli dans le coefficient de diffusion4. Dans le cas de deux couleurs FCS ou HCFC, seulement 50 % des homo-dimères verra pour la même raison que ci-dessus. Approche la plus pragmatique et quantitatives pour détecter les homo-dimérisation in vitro et in vivo est homo-FRET5 , nombre et luminosité (N & B)6. Compte tenu du fait que homo-FRET exige une instrumentation spécifique récupération de la valeur de l’anisotropie (c.-à-d., optique éléments/analyseurs de récupérer la polarisation parallèle et perpendiculaire), N & B sont présentée ici comme une technique favorable à détecter la protéine homo-dimérisation et agrégation. Il peut être employé aussi bien in vitro et in vivo avec une installation commerciale.
Nombre et la luminosité
N & B a été récemment révisé7. Cet examen a porté sur l’application de la technique dans des cellules vivantes. Il est utile de reproduire le formalisme mathématique ici comme ces équations s’appliqueront aux données collectées in vitro. Tout d’abord, il est nécessaire de définir certains termes et quantités mathématiques :
- Une entité est un ensemble de molécules qui sont liés entre eux.
- La ε de luminosité d’une entité est le nombre de photons, qu’il émet par unité de temps (par image).
- n est le nombre d’entités présentes.
- D’un pixel donné au cours d’une série d’image, est que sa moyenne intensité et σ2 est la variance dans son intensité.
Puis, avec détecteurs de comptage de photons et en supposant que les entités mobiles et pas de fond,
où N est le nombre apparent et B est la luminosité apparente. Cela se traduit par
Dali et al. 8 a montré qu’avec un équipement analogique, il faut trois termes de correction : le facteur S, l’ arrière-plan offsetet le bruit de lecture σ02. Puis, à nouveau en supposant que les entités mobiles,
ce qui donne
Noter que l’équation ci-dessus pour est différente de celle donnée dans Dali et al. 8 et une révision ultérieure. 7 à Dali et coll. le S dans le dénominateur a été omis en raison d’une faute de frappe, et cette erreur a été reproduite dans la revue. L’équation ci-dessus est la bonne. Instructions pour la mesure de S, offset et σ02 – ainsi qu’une explication de leur sens – sont donnés par Dali et al. 8
La ε de luminosité est proportionnelle à l’État oligomère des entités diffusants : ε sera deux fois plus gros pour les dimères comme c’est pour les monomères, trois fois plus gros pour trimères comme c’est pour les monomères, deux fois aussi grands pour hexamères comme c’est des trimères et ainsi de suite. De cette façon, en mesurant la luminosité ε, on peut quantifier tout type de multimerization.
S’il y a un mélange d’oligomères Etats présents, nombre et la luminosité n’est pas capable de récupérer les différents États d’oligomères présents. Il s’agit d’une limitation de la technique.
Detrend logiciel d’algorithme et nandb
L’importance de la correction pour le photoblanchiment a été souligné précédemment9. Photoblanchiment se produit inévitablement au cours d’expériences de microscopie photonique en mode Time-lapse ; aussi bien dans des cellules vivantes et in vitro. Plusieurs approches ont été décrits dans la littérature pour corriger pour la décoloration des7. La technique de filtrage exponentielle avec choix automatique de paramètre de la méthode T est le meilleur actuel. Elle est intégrée dans le nandb du logiciel open source gratuit,9. En effet, un logiciel qui oblige l’utilisateur à choisir manuellement leur paramètre de méthode peut conduire à des résultats incorrects parce que ce choix de paramètre sera probablement arbitraire et erronée. L’algorithme automatique vérifie les données et détermine le paramètre approprié pour elle, sans la nécessité d’une intervention de l’utilisateur9. Même avec le meilleur choix du paramètre de lissage, dissociation a ses limites et ne fonctionne bien qu’avec photoblanchiment pourcentages inférieurs à 25 %, comme le montre avec des simulations9. Fait intéressant, lorsque vous utilisez la méthode de routine automatique, sa précision est telle que l’on peut travailler avec des valeurs de luminosité faible (même B < 1,01), d'où de faibles intensités et encore être assez précis pour quantifier les homo-dimérisation.
Photoblanchiment provoque aussi un autre problème : la présence de fluorophores photobleached dans un polymère complexe. Ce qui rend par exemple, un trimère apparaissent comme un dimère lorsque l’une des trois unités dans le trimère est non fluorescent. Hur et Mueller10 a montré comment faire pour corriger cela et cette correction a également été soulignée dans une révision ultérieure7. Le logiciel de nandb comprend cette correction9.
La FKBP12 F36V système
FKBP12F36V est une protéine qui ne pas naturellement oligomerize, mais sait se dimériser lors de l’addition des drogues (familièrement appelé le BB dimérisation ligand)11,AP2018712. Cela en fait un cas de test idéal pour le nombre et l’éclat : avec FKBP12F36V marqués, un doublement des oligomère État doit être observé lors de l’addition de BB.
Protocol
Representative Results
Discussion
N & B sont une technique pour détecter les multimerization à l’aide de lumière commercial balayage confocal microscopes équipés de détecteurs numériques. Cette approche est assez attrayante par rapport à point unique FCS, SCCC et smFRET parce qu’il est libre d’étalonnage et le calcul de la luminosité est simple et concentration indépendant6. Il est important, cependant, afin de corriger les fluctuations d’intensité de blanchiment et à long terme avant d’effectuer les calculs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust accorder 105278/Z/14/2 de R.N. Le Wellcome Trust Centre for Human Genetics est financé par Wellcome Trust Core prix 203852/Z/16/2. Travaux du groupe C.S. est pris en charge par Cancer Research UK (C20724/A14414) et le Conseil européen de la recherche au titre de l’Union européenne Horizon 2020 recherche et Innovation Programme Grant 647278.
Materials
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
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