Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.
Abstract
Anzahl und Helligkeit ist eine Kalibrierung-freie Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie (FFS) Technik zum Nachweis von Protein Homo-Oligomerisierung. Es kann eingesetzt werden, mit einem herkömmlichen confocal Mikroskop mit digitaler Detektoren ausgestattet. Ein Protokoll für den Einsatz von Technik in Vitro wird mittels einem Use Case gezeigt wo Zahl und Helligkeit zu genau den Oligomeren Stand der mVenus versehenen FKBP12F36V vor und nach der Zugabe der dimerizing Droge AP20187 quantifizieren gesehen werden kann. Die Bedeutung der Verwendung der richtigen Mikroskop Aufnahmeparameter und die korrekten Daten-Vorverarbeitung und Analyse-Methoden werden diskutiert. Insbesondere wird die Bedeutung der Wahl der Immunofluoreszenz Korrektur betont. Diese kostengünstige Methode kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen in vielen biologischen zusammenhängen zu studieren.
Introduction
Protein-Protein Interaktionen ich n-vitro-
Traditionell sind die Kristallographie und Kernspinresonanz-Experimenten mit Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) kombiniert die Technologien entschieden, genau zu beschreiben, die dreidimensionale Architektur der Proteine und ihre Funktion durch Ableiten hinterfragen ihre hochauflösende strukturelle Details. Proteine, jedoch sind keine statischen Strukturen und können eine Vielzahl von Konformationsänderungen und Schwingungen in Zeit und Raum zu unterziehen. Deshalb ist die strukturelle Informationen aus kristallographischen oder CryoEM Daten müssen mit anderen Techniken (z. B. Molekulardynamik-Simulationen und Einzelmolekül-Techniken) ergänzt werden: die Funktion eines Proteins ist im Zusammenhang mit seiner Konformationsänderungen Änderungen und Interaktionen und diese Information ist nicht vorhanden in einer statischen Struktur. Um intramolekularer Dynamik untersuchen, sind Techniken, basierend auf einzelnen Moleküls Forster Resonanz Energietransfer (SmFRET) sehr effektiv1. Diese Ansätze sind verschiedene Subpopulationen von Molekülen in komplexen Medien beurteilen können. Dies ist sehr wichtig, da diese Änderungen schnelle sind und während der Erfassung der Daten (d. h. Nanosekunde, zweite Reihe treten).
Zwei Hauptansätze werden häufig eingesetzt, um zu erkennen und diese Änderungen zu quantifizieren: Proteine in Lösung und Oberfläche-Immobilisierung. Für den Nachweis der Inter molekularen Wechselwirkungen und insbesondere den Prozess der Dimerisierung von Liganden induzierte, ist SmFRET nicht immer das beste Werkzeug. In der Tat Bund richtet sich nicht nur auf der Strecke (≈10 nm), sondern auch auf die Ausrichtung der beiden Dipole (Donor und Akzeptor, χ2) und die Überlappung der Spender-Emission mit den Akzeptor Absorptionsspektren2, aber vielleicht diese letzte Bedingung ist weniger vorausgesetzt, dass der Experimentator kann wählte wichtig, das richtige Paar Bund. Ein besonderer Nachteil von SmFRET zum Sondieren Homo-Dimerisierung stammt aus der Kennzeichnung des Proteins des Interesses: für Hetero SmFRET Dimerisierung kann nur festgestellt, bis zu 50 % (d.h., Hetero-FRET werden nur Donor-Akzeptor zu erkennen und Akzeptor-Spender Homo-Dimere aber nicht Spender Spender oder Akzeptor-Akzeptor, die die anderen 50 % von der Dimere). Die Verwendung von Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) und Derivaten (FCC, etc.3), Protein Verbreitung Konstanten und verbindliche Konstanten in Vitro zu ermitteln ist eine weitere Alternative. Diese Ansätze sind nicht in der Lage, vollständig Homo-Dimerisierung entweder zu quantifizieren, wie FCS 1 Maßnahmen Konzentration und Diffusion, und den Radius und die Verbreitung Koeffizienten eines diffundierende Teilchen sind sehr schlecht das Molekulargewicht abhängig; zum Beispiel wird ein 10-divisibel Anstieg des Molekulargewichtes nur eine 2.15 Falte Änderung in der Verbreitung Koeffizient4verbunden. Bei zweifarbigen FCS oder FCC werden nur 50 % der Homo-Dimere aus dem gleichen Grund wie oben gesehen. Praktische und quantitative Ansätze, Homo-Dimerisierung in Vitro und in Vivo zu erkennen sind Homo-Bund5 und der Anzahl und der Helligkeit (N & B)6. Angesichts der Tatsache, dass Homo-FRET erfordert spezielle Instrumente Erholung von der Anisotropie-Wert (z. B. optische Elemente/Analyzer, die parallele und senkrechte Polarisation wiederherzustellen), N & B präsentiert hier als eine günstige Methode, um erkennen Sie Protein Homo-Dimerisierung und Aggregation. Es kann sein, beschäftigt, sowohl in Vitro und in Vivo eine kommerzielle Einrichtung.
Anzahl und Helligkeit
N & B wurde erst kürzlich überarbeitete7. Dieser Beitrag konzentriert sich auf die Anwendung der Technik in lebenden Zellen. Es lohnt sich, reproduzieren die mathematische Formalismus hier als diese Gleichungen auf die Daten angewendet werden gesammelt in Vitro. Erstens ist es notwendig, einige Begriffe und mathematische Mengen zu definieren:
- Eine Entität ist eine Reihe von Molekülen, die miteinander verbunden sind.
- Die Helligkeit ε einer Entität ist die Anzahl der Photonen, die es pro Zeiteinheit (pro Frame) aussendet.
- n ist die Anzahl der Elemente vorhanden.
- Für eines bestimmten Pixels im Laufe einer Bilderserie ist seine mittlere Intensität und σ2 die Varianz in ihrer Intensität.
Dann, mit Photon counting Detektoren und vorausgesetzt, mobile Einheiten und keinen Hintergrund,
Dabei ist N die scheinbare Zahl und B ist die scheinbare Helligkeit. Dies führt zu
Dalal Et al. 8 zeigte, dass mit analogem Equipment, man drei Korrektur Begriffe braucht: S-Faktor, der Hintergrund- Offsetund die Auslesen Lärm σ02. Dann wieder vorausgesetzt, mobile Einheiten,
Geben
Beachten Sie, dass die obige Gleichung für unterscheidet, die in Dalal Et Al. 8 und einer nachträglichen Prüfung. 7 in Dalal Et Al. S im Nenner wurde durch einen Tippfehler verzichtet und dieser Fehler wurde bei der Überprüfung reproduziert. Die obigen Gleichung ist die richtige. Anweisungen für die Messung von S, Offset und σ02 – zusammen mit einer Erläuterung ihrer Bedeutung – sind gegeben durch Dalal Et Al. 8
Die Helligkeit ε ist proportional zu den Oligomeren Zustand der diffundierende Entitäten: ε werden zweimal für Dimere so groß, wie es für Monomere, dreimal so groß für Trimere ist, wie es für Monomere, für Hexamers doppelt so groß ist wie für Trimere und so weiter. Auf diese Weise messen die Helligkeit ε kann man jede Art von Multimerization quantifizieren.
Gibt es eine Mischung aus Oligomeren Staaten vorhanden, ist Anzahl und Helligkeit nicht in der Lage erholt die Oligomeren Einzelstaaten vorhanden. Dies ist eine Einschränkung der Technik.
Detrend-Algorithmus und Nandb software
Die Bedeutung der Korrektur für Immunofluoreszenz wurde betont zuvor9. Immunofluoreszenz tritt unweigerlich während der Lichtmikroskopie Experimente im Zeitraffer-Modus; sowohl in lebenden Zellen und in Vitro. Viele Ansätze wurden in der Literatur zu korrigieren zum Bleichen7beschrieben. Die exponentielle filternde Technik mit automatischer Wahl der detrending Parameter T ist die derzeit besten. Es ist kostenlos, open Source Software Nandb9integriert. In der Tat kann Software, die die Benutzer manuell wählen ihre detrending Parameter erfordert zu falschen Ergebnissen führen, da diese Parameter Wahl wahrscheinlich willkürlich und falsch sind. Der Automatische Algorithmus prüft die Daten und bestimmt den entsprechenden Parameter, ohne die Notwendigkeit der Benutzer eingreifen9. Auch mit die beste Wahl von glättende Parameter detrending hat seine Grenzen und funktioniert auch nur mit Immunofluoreszenz Prozentsätze niedriger als 25 %, wie abgebildet, mit Simulationen9. Interessant ist, wenn Sie die automatische detrending Routine zu verwenden, die Genauigkeit ist so, dass man mit geringer Helligkeitswerten arbeiten kann (sogar B < 1.01), und somit geringe Intensitäten, und immer noch präzise genug, um Homo-Dimerisierung zu quantifizieren.
Immunofluoreszenz verursacht auch ein weiteres Problem: die Anwesenheit von Photobleached Fluorophore in einem komplexen Multimer. Dies macht z. B. ein Trimer erscheinen wie ein Dimer, wenn eines der drei Geräte in das Trimer nicht fluoreszierenden ist. Hur und Mueller10 zeigte, wie man dies zu korrigieren und diese Korrektur wurde auch in einer nachträglichen Prüfung7hervorgehoben. Die Nandb-Software enthält diese Korrektur-9.
Die FKBP12 F36V System
FKBP12F36V ist ein Protein, das natürlich nicht oligomerize aber bekannt ist, auf den Zusatz von AP20187 Medikamenten (umgangssprachlich bekannt als die BB dimerizing Liganden)11,12Dimere. Dies macht es ein idealer Prüfstein für Anzahl und Helligkeit: mit beschrifteten FKBP12F36V, eine Verdoppelung der Oligomere Zustand nach Zugabe von BB beobachtet werden sollte.
Protocol
Representative Results
Discussion
N & B ist eine Technik, um Multimerization mit kommerziellen Licht Scannen konfokale Mikroskopen ausgestattet mit digitaler Detektoren erkennen. Dieser Ansatz ist sehr attraktiv im Vergleich zu single Point FCS, FCC und SmFRET weil es kostenlose Kalibrierung und die Berechnung der Helligkeit ist unkompliziert und Konzentration unabhängigen6. Es ist von großer Bedeutung, jedoch für Bleichen und langfristige intensitätsschwankungen zu korrigieren, bevor Sie Helligkeit Berechnungen<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Wellcome Trust unterstützt gewähren R.N 105278/Z/14/2 Der Wellcome Trust Centre for Human Genetics wird vom Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2 finanziert. Arbeit in der c.s.-Gruppe wird von Cancer Research UK (C20724/A14414) und des European Research Council unter Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm Grant 647278 der Europäischen Union unterstützt.
Materials
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
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