Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Protein-protein etkileşimleri ben n in Vitro

Geleneksel olarak, kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu (cryoEM) ile birlikte nükleer manyetik rezonans deneyler doğru proteinlerin üç boyutlu mimari tanımlamak için ve işlevlerine göre anlaması için seçilmiş teknolojiler vardır onların yüksek çözünürlüklü yapısal detayları scrutinizing. Proteinler, ancak, statik yapılar değildir ve konformasyon değişiklikleri ve titreşim çeşitli zaman ve mekan içinde tabi olabilir. Bu yapısal yüzden bilgi crystallographic veya CryoEM veri (Örneğin, moleküler dinamiği simülasyonları ve tek molekül teknikleri) diğer teknikleri ile tamamlanabilir: işlev bir proteinin konformasyon için ilişkilidir değişiklikleri ve etkileşimleri ve bu bilgileri bir statik yapısı içinde mevcut değil. İntra moleküler dynamics için yoklama için çok etkili¹Forster rezonans enerji transferi (smFRET) tek molekül dayalı teknikler vardır. Bu yaklaşımlardan farklı altgrupları karmaşık medya olarak değerlendirmek edebiliyoruz. Bu değişikliklerin hızlı ve veri (Örneğin, ikinci aralığı için nanosecond) edinimi sırasında oluşan çok önemlidir.

İki ana yaklaşım yaygın olarak algılamak ve bu değişiklikleri ölçmek için istihdam edilmektedir: proteinler çözüm ve yüzey-immobilizasyon. Arası moleküler etkileşimleri ve özellikle, ligandlar tarafından indüklenen dimerization süreci algılama için smFRET her zaman en iyi araç değildir. Gerçekten de, sadece mesafe (≈10 nm) ama aynı zamanda iki dipoller (donör ve alıcısı, χ²) yönünü FRET bağlıdır ve donör emisyon alıcısı’nın emilimi spectra², ama belki de bu son durum ile çakışma azdır koşuluyla deneyci olabilir önemli değil FRET çift açmadı. SmFRET homo-dimerization problama için belirli bir dezavantaj faiz protein etiketleme üzerinden gelir: hetero smFRET için dimerization sadece olabilir % 50 tespit (Yani, hetero-perde sadece donör-alıcısı algılamak mümkün olacak ve alıcısı-donör homo-dimer ama değil donör verici veya alıcısı-alıcısı, dimer diğer % 50). Floresans korelasyon spektroskopisi (FCS) ve türevleri (protein difüzyon sabitler ve bağlama sabitler vitro tespit etmek için FCCS, vb³) başka bir alternatif kullanmaktır. Bu yaklaşımların tamamen homo-dimerization de ölçmek mümkün değildir, FCS bir önlemler konsantrasyon ve difüzyon ve RADIUS ve difüzyon katsayısı bir akışkanın parçacık olduğu gibi çok kötü moleküler ağırlık bağlıdır; Örneğin molekül ağırlığı 10 kat artış sadece 2,15 kat değişim difüzyon katsayısı⁴ima. İki renkli FCS veya FCCS, homo-dimer sadece % 50’si aynı sebepten dolayı yukarıdaki gibi görülecektir. Homo-dimerization vitro ve in vivo algılamak için en pratik ve kantitatif yaklaşımlar homo-perde⁵ ve numarası ve parlaklık (Y & B)⁶vardır. Aslında verildi ki homo-perde gerektirir belirli araçları kurtarma anizotropi değeri (Yani, optik elemanları/paralel ve dikey polarizasyon kurtarmak için analiz sistemleri), N & B sunulan burada olumlu bir teknik olarak protein homo-dimerization ve toplama algılar. O-ebilmek var olmak vitro ve in vivo ticari bir kurulum ile istihdam.

Numarası ve parlaklık

N & B son zamanlarda gözden geçirilmiş⁷oldu. O eleştiriyi canlı hücreleri tekniğinde uygulanması üzerinde duruldu. İçin faydalıdır bu denklemler olarak matematiksel biçimcilik verilere uygulanacak yeniden toplanan içinde vitro. İlk olarak, bazı terimleri ve matematiksel miktarları tanımlamak gereklidir:

• Birbirimize bağlıyız molekülleri bir dizi bir varlıktır.
• Bir varlığın parlaklık ε birim birim zamanda (kare) başına yayar fotonlar sayısıdır.
• n varlıklar mevcut sayısıdır.
• Bir görüntü serisi boyunca belirli bir piksel için onun ortalama yoğunluğu ve σ² şiddeti varyans olmasıdır.

O zaman, foton sayma dedektörleri ve varsayarak hareket eden varlıklar ve hiçbir arka plan ile

N B ve belirgin numarası olan belirgin parlaklıkolduğunu. Bu sonuçlar

Gamze vd. ⁸ gösterdi analog ekipman ile bir üç düzeltme dönem gerekir: S faktörü, arka plan ofsetve okuma gürültü σ₀². O zaman, tekrar hareket eden varlıklar varsayarsak,

veren

Yukarıdaki Denklem için farklı olduğuna dikkat edin gamze ve ark. içinde verilen ⁸ ve sonraki bir daha gözden geçirme. ⁷ içinde gamze vd. S payda içinde bir yazım hatası nedeniyle ihmal ve bu hata İnceleme çoğaltılamaz. Yukarıdaki denklem doğru olandır. Talimatları Sölçmek için uzaklık ve σ₀² – anlamlarını – açıklaması ile birlikte verilen tarafından gamze vd. ⁸

Parlaklık ε akışkanın varlıkların oligomeric durumuna orantılıdır: ε iki kez ve benzeri trimers için olduğu gibi monomerleri, iki kez hexamers için büyük için olduğu gibi monomerleri, trimers için üç kez büyük için olduğu gibi dimer için büyük olacak. Böylece parlaklık ε, ölçme, bir multimerization her türlü ölçmek.

Varsa mevcut, sayı oligomeric Birleşik bir karışımı ve parlaklığı bireysel oligomeric Birleşik mevcut kurtarma yeteneğine sahip değildir. Bu tekniğin bir kısıtlamadır.

Algoritma ve nandb yazılım detrend

Have be photobleaching düzeltme önemini daha önce⁹vurguladı. Photobleaching kaçınılmaz olarak hızlandırılmış modunda ışık mikroskobu deneyler sırasında oluşur; hem canlı hücreleri ve içinde vitro. Pek çok yaklaşım⁷beyazlatma için düzeltmek için literatürde tarif edilmistir. Üstel filtreleme detrending parametre T otomatik seçeneği ile mevcut en iyi tekniktir. Ücretsiz, açık kaynak yazılım nandb⁹içine entegre edilmiştir. Gerçekten de, bu parametre seçim büyük olasılıkla keyfi ve yanlış olacaktır çünkü onların detrending parametre el ile seçmek Kullanıcı yazılımlar hatalı sonuçlara yol açabilir. Otomatik algoritması verileri inceler ve uygun parametresi, Kullanıcı müdahalesi⁹için gerek kalmadan belirler. Hatta en iyi seçim düzeltme parametresi ile detrending kendi sınırlamaları vardır ve iyi sadece photobleaching yüzde %25 düşük simülasyonlar⁹ile gösterildiği gibi çalışır. Öyle ki bir parlaklığı düşük değerlerle çalışabilirsiniz ilginçtir, otomatik detrending rutin, onun doğruluğunu kullanıldığında (hatta B < 1,01) ve bu nedenle düşük yoğunluklarda ve hala homo-dimerization ölçmek için kesin olarak.

Photobleaching da başka bir sorun neden olur: photobleached fluorophores içinde karmaşık bir multimer varlığı. Bu bir trimer görünür bir dimer gibi trimer olarak üç birimi olmayan flüoresan olduğunda Örneğin, yapar. Hur ve Mueller¹⁰ için bu sorunu gidermek nasıl gösterdi ve bu düzeltme da bir sonraki İnceleme⁷‘ vurguladı. Bu düzeltme⁹nandb yazılımlardır.

FKBP12 F36V sistem

FKBP12F36V hangi değil doğal olarak oligomerize ama AP20187 ilaç (halk dilinde ligand dimerizing BB da bilinir)^11,12eklenmesi dimerize için bilinen bir proteindir. Bu sayı ve parlaklık için ideal bir test çalışması yapar: etiketli FKBP12F36V ile oligomeric durumunu iki katına BB eklenmesi dikkat edilmelidir.