Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto
Summary
Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.
Abstract
As propriedades mecânicas do núcleo determinam sua resposta às forças mecânicas geradas nas células. Porque o núcleo é molecularmente contínuo com o citoesqueleto, métodos são necessários para sondar seu comportamento mecânico em células aderentes. Aqui, vamos discutir a sonda de força direta (DFP) como uma ferramenta para aplicar a força diretamente para o núcleo em uma célula aderente viva. Atribuímos uma micropipeta estreita à superfície nuclear com sucção. A micropipeta é traduzida longe do núcleo, o que faz com que o núcleo se deforma e traduzir. Quando a força restauradora é igual à força de sucção, o núcleo desconecta e elasticamente, relaxa. Porque o pressão de sucção é precisamente conhecido, é conhecida a força na superfície nuclear. Este método revelou-se que as forças de nano-escala são suficientes para deformar-se e traduzir o núcleo nas células aderentes e identificaram elementos do citoesqueleto que permitem que o núcleo resistir às forças. O DFP pode ser usado para dissecar as contribuições dos componentes celulares e nucleares para propriedades mecânicas nucleares em células vivas.
Introduction
Patologias como câncer envolvem alterações à forma nuclear e estrutura1,2, que geralmente são acompanhados de um amolecimento do núcleo3,4. Nuclear resistência à deformação mecânica tem sido geralmente caracterizada pela aplicação de uma força de núcleos isolados5.
O núcleo nas células molecularmente está ligado ao citoesqueleto pelo vinculador de Nucleoskeleton e citoesqueleto (LINC) complexo6,7,8,9. Como resultado, o núcleo mecanicamente é integrado com o citoesqueleto e, através de aderências célula-substrato, a matriz extracelular. Mecanicamente, sondar o núcleo no interior das células aderentes pode fornecer insights sobre essa integração mecânica. Métodos para manipular os núcleos em células vivas incluem micropipeta aspiração10,11e microscopia de força atômica a12,13,14. Recentemente descrevemos uma sonda de força direta (DFP) que se aplica forças mecânicas diretamente no núcleo em uma vida aderentes célula15.
Aqui, podemos descrever o procedimento para usar um sistema de microinjeção que está geralmente disponível em instalações de microscopia para aplicar uma força mecânica de nano-escala conhecida, diretamente para o núcleo em uma célula aderente. Um femtotip (0,5 µm ponta de micropipeta de diâmetro) é montado e ligado ao sistema de microinjeção por um tubo. A ponta, posicionada em um ângulo de 45° em relação à superfície do prato, cultura é abaixada até adjacente à superfície nuclear. O tubo é então desligado e aberto para a atmosfera, o que cria uma pressão negativa de sucção na superfície nuclear e lacra a ponta da micropipeta contra a superfície nuclear. Através da tradução da ponta da micropipeta, o núcleo é deformado e eventualmente (dependendo da magnitude da força aplicada), extraído da micropipeta. Este desprendimento ocorre quando as forças de restaura (oposição), exercidas pelo núcleo e célula, igual a força de sucção aplicada pela micropipeta. Análise pode ser realizada medindo-se o deslocamento do núcleo, a estirpe de comprimento (equação 1), ou a tensão da área (figura 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Medindo a integração mecânica do núcleo com o citoesqueleto é um desafio para métodos mais atuais, como micropipeta aspiração16, pois eles exigem ou núcleos isolados (onde o núcleo é dissociado do citoesqueleto) ou núcleos em células suspensos (onde forças extracelulares, como forças de tração, estão ausentes). Força aplicou-se para o núcleo aplicando tensão biaxial de aderente de células a uma membrana17,,18; no enta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 EB014869.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
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