تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون
Summary
في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة ميكروبيبيتي لمباشرة تطبيق قوة الخاضعة للرقابة على النواة في خلية حية. ويسمح هذا الفحص الاستجواب للخصائص الميكانيكية النووية في الخلية الحية، وملتصقة.
Abstract
تحديد الخواص الميكانيكية للنواة ردها إلى القوات الميكانيكية المتولدة في الخلايا. نظراً لأن النواة جزيئيا المستمر مع سيتوسكيليتون، يلزم أساليب التحقيق سلوكها الميكانيكي في الخلايا ملتصقة. وهنا نناقش المسبار القوة المباشرة (منسقي) كأداة لتطبيق القوة مباشرة إلى النواة في خلية حية ملتصقة. أننا نعلق ميكروبيبيتي ضيقة على السطح النووي مع الشفط. وتترجم في ميكروبيبيتي بعيداً عن النواة، الذي يسبب النواة تشوه وترجمة. عند استعادة قوة مساوية لقوة الشفط، النواة يفصل ويرتاح الاستيكالي. لأن الضغط شفط هو يعرف على وجه التحديد، المعروف قوة على السطح النووي. هذا الأسلوب وكشفت أن قوات نانو الحجم كافية لتشوه وترجمة النواة في خلايا ملتصقة، وحددت العناصر سيتوسكيليتال التي تمكن النواة مقاومة القوات. يمكن استخدامها منسقي تشريح مساهمات المكونات الخلوية والنووية للخصائص الميكانيكية النووية في الخلايا الحية.
Introduction
الأمراض مثل السرطان تنطوي على تعديلات على الشكل النووي وهيكل1،2، التي تقترن عادة ب ‘تليين’3،نواة4. المقاومة النووية إلى تشوه الميكانيكية اتسمت عموما بتطبيق قوة على نواة معزولة5.
النواة في الخلايا متصل جزيئيا cytoskeleton “رابط نوكليوسكيليتون” وسيتوسكيليتون (اللغوي) مجمع6،7،،من89. نتيجة لذلك تم دمج النواة ميكانيكيا مع سيتوسكيليتون، ومن خلال خلية التحتية الالتصاقات، المصفوفة خارج الخلية. ميكانيكيا السبر النواة داخل الخلايا ملتصقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة هذا التكامل الميكانيكية. وتشمل أساليب التلاعب بالنوى في الخلايا الحية ميكروبيبيتي تطلع10،11، والقوة الذرية مجهرية12،،من1314. ونحن مؤخرا وصف قوة مباشرة تحقيق (منسقي) الذي ينطبق على القوات الميكانيكية مباشرة على النواة في خلية ملتصقة معيشة15.
هنا، فإننا مخطط الإجراء المتعلق باستخدام نظام microinjection التي تتوفر عادة في مرافق الفحص المجهري لتطبيق قوة ميكانيكية نانو نطاق معروفة، مباشرة إلى النواة في زنزانة ملتصقة. فيمتوتيب (القطر ميكروبيبيتي نصيحة 0.5 ميكرومتر) شنت ومتصلا بالنظام microinjection بأنبوب. تلميح، المتمركزة بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى سطح الطبق الثقافة، خفضت حتى المتاخمة لسطح النووية. ثم قطع الأنبوب وفتحه في الغلاف الجوي، مما يخلق ضغط شفط سلبي على السطح النووي والأختام نصيحة ميكروبيبيتي ضد السطح النووية. من خلال ترجمة طرف ميكروبيبيتي، النواة مشوهاً وفي نهاية المطاف (تبعاً لحجم القوة المطبقة)، بعيدة عن ميكروبيبيتي. هذه المفرزة عند تساوي القوى (مقاومة) استعادة، تمارسه خلية ونواة قوة الشفط تطبقها ميكروبيبيتي. يمكن إجراء التحليل بقياس تشريد النواة، سلالة طول (المعادلة 1)، أو سلالة المنطقة (الشكل 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
قياس تكامل الميكانيكية نواة مع سيتوسكيليتون تحد للأساليب الأكثر حداثة، مثل ميكروبيبيتي تطلع16، لأنها تتطلب أما نواة معزولة (حيث النواة decoupled من cytoskeleton) أو النواة في الخلايا مع وقف التنفيذ (حيث توجد القوات خارج الخلية، مثل قوي الجر،). طبق النواة القوة عن طريق تطبيق سلالة بياكسي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل EB014869 R01 المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
