核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ
Summary
このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。
Abstract
核の機械的性質は、細胞で生成された機械的な力への応答を決定します。核が細胞骨格の分子に連続しているため付着細胞での力学的挙動を調べるための方法が必要です。ここでは、付着性細胞の核に直接力を適用するためのツールとして直接力プローブ (DFP) について述べる。我々 は、吸込みを伴う核の表面に細いピペットを添付します。マイクロ ピペットは、翻訳を変形させ、核を引き起こす核から変換されます。復元力が吸引力に等しい、核はデタッチし、弾性を緩和します。吸引圧が正確に知られているために、核の表面に働く力が知られています。このメソッドは、ナノの力が変形し、付着細胞で核を翻訳するのに十分なされ、力に抵抗する核を可能にする骨格の要素を明らかにしました。DFP を使用して、細胞内の核の力学特性に細胞や原子力部品の貢献を分析できます。
Introduction
癌などの疾患は、核の形状と構造1,2, ” 核3,4の軟化に伴う一般的に変化を含みます。原子力機械変形抵抗は、隔離された核5に力を適用することで一般的に特徴づけられています。
細胞核は細胞骨格に Nucleoskeleton リンカーと細胞骨格 (バイオス) 複雑な6,7,8,9分子接続されます。その結果、核は、細胞骨格と、細胞-基質間の癒着、細胞外マトリックスを機械的に統合されています。機械的に付着性細胞の中の核を探るこの機械的統合への洞察力を提供できます。マイクロ ピペット吸引10、11、および原子間力顕微鏡12,13,14生きた細胞中の核を操作するメソッドが含まれます。最近生活付着性のセル15に核に直接機械的な力を適用する直接力プローブ (DFP) について述べる。
ここでは、我々 は付着性細胞の核に直接知られているナノ機械的な力を適用する顕微鏡施設で利用可能なインジェクション システムを使用する手順を概説します。Femtotip (0.5 μ m 径マイクロ ピペット チップ) がマウントされ、チューブでのインジェクション システムに接続されています。まで核の表面に隣接して、培養皿の表面に対して 45 ° の角度で配置されている、先端が低下します。チューブは切断し、核の表面に負の吸引圧を作成し、核の表面に対してマイクロ ピペット先端をシール大気開放します。マイクロ ピペット チップの翻訳を通じて核は変形し、最終的に (力の大きさ) によって、マイクロ ピペットを切り離します。この剥離は、核および細胞、によって出される、復元 (耐熱) 力、ピペットによって適用される吸引力の等しい場合に発生します。核の変位を測定することによって分析を行うことが長さひずみ (式 1)、または領域のひずみ (図 1 a)。
Protocol
Representative Results
Discussion
彼らはいずれかの隔離された核 (核は細胞骨格から分離) を必要とするためピペット吸引16など、最新の方法のための挑戦は、細胞骨格に核の機械的統合を測定または核浮遊細胞 (細胞外の力、牽引力などは欠席)。力は、軸ひずみを膜17,18; に付着性のセルに適用することで、核に適用されています。ただし、この手法は、核の力が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH R01 EB014869 によって支えられました。
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
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