Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет
Summary
В этом протоколе мы описываем метод микропипеткой непосредственно применять контролируемых силой к ядру в живой клетке. Этот assay позволяет допроса ядерных механических свойств в живых, адэрентных клеток.
Abstract
Механические свойства ядра определяют свой ответ на механических сил, созданных в клетках. Поскольку ядро молекулярно непрерывный с цитоскелета, методы необходимы для зонда его механического поведения в адэрентных клеток. Здесь мы обсуждаем прямой силы зонд (DFP) как инструмент для применения силы прямо к ядру в живых адэрентных клеток. Мы придаем узкие микропипеткой ядерной поверхности с всасывания. Микропипеткой переводится от ядра, который вызывает ядро деформируется и перевести. Когда восстановление сил равна силе всасывания, ядро отсоединяется и упруго расслабляет. Потому что давление всасывания точно известно, известно на поверхности ядерных сил. Этот метод показал, что нано-силы достаточно, чтобы деформировать и перевести ядро в адэрентных клеток и определены цитоскелетных элементов, которые включают ядро противостоять силам. DFP может использоваться для рассечения вклад сотовой и ядерных компонентов ядерных механических свойств в живых клетках.
Introduction
Патологий, таких как рак включают изменения в ядерной форма и структура1,2, которые обычно сопровождаются «размягчения» ядра3,4. Ядерные устойчивость к механической деформации обычно характеризуются применения силы для изолированных ядер5.
Ядро в клетках молекулярно подключен к цитоскелета компоновщик Nucleoskeleton и цитоскелета (линк) комплекс6,,78,9. В результате ядро механически интегрирована с цитоскелета и через ячейки субстрат спайки, внеклеточного матрикса. Механически зондирования ядра внутри адэрентных клеток может обеспечить понимание этой механической интеграции. Методы для манипулирования ядер в живых клетках включают микропипеткой аспирации10,11и атомно-силовой микроскопии12,,1314. Мы недавно описал прямой силы зонд (DFP), который применяется непосредственно на ядро в живых адэрентных клеток15механических сил.
Здесь мы приводим порядок использования микроинъекции системы, которая обычно доступна в микроскопии средств для применения известных, нано-механической силы непосредственно к ядру в адэрентных клеток. Femtotip (0,5 мкм диаметром микропипеткой наконечник) установлен и подключен к системе микроинъекции трубку. Кончик, расположены под углом в 45° по отношению к поверхности культуры блюдо, опускается до прилегающих к ядерной поверхности. Трубка затем отключен и открыт для атмосферы, которая создает отрицательное давление всасывания на поверхности ядерной и уплотнения кончик микропипеткой против ядерной поверхности. Через перевод кончика микропипеткой ядро деформируется и в конечном итоге (в зависимости от масштабов применения силы), отделен от микропипеткой. Этот отряд возникает, когда восстановление (сопротивления) сил, оказываемое ядро и ячеек, равное всасывающее усилие микропипеткой. Анализ может выполняться путем измерения смещения ядра, длина штамм (уравнение 1), или площадь штамм (рис. 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерительные механические интеграции ядра с цитоскелета является проблемой для наиболее текущие методы, такие как микропипеткой стремление16, потому что они требуют либо отдельных ядер (где ядро отделенных от цитоскелета) или ядер в подвесной клетки (где внеклеточного си…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R01 EB014869.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
