Caenorhabditis Elek: Bir düşük teknoloji enstrüman ve küçük çok hücreli organizmalar sıralama yöntemi
Summary
Geçerli protokol sıralama ve nüfus yaş eşlemeli temizlik için bir metodoloji içerir Caenorhabditis elegans. Nematodlar araştırma için büyük bir deneysel nüfusa elde etmek için basit, ucuz ve verimli özel yapım aracı kullanır.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) temel ve Biyomedikal araştırma bir dizi kullanılan bir iyi kurulmuş model organizmadır. Nematot araştırma topluluğu içinde C. elegansbüyük, Yaş eşlemeli nüfusu korumak uygun fiyatlı ve etkili bir şekilde gerek yoktur. Burada, mekanik olarak sıralama ve C. eleganstemizlik için bir metodoloji mevcut. Amacımız hayvanlar Tekdüzen boyutları ve yaşam evreleri deneyler kullanımları için elde etmek için düşük maliyetli, verimli, hızlı ve basit bir süreç sağlamaktır. Bu araç, Caenorhabditis elek, ortak konik Laboratuvar tüpleri konu ve gövde boyutuna göre C. elegans sıralar bir ölçüye göre kapak sistemi kullanır. Biz de Caenorhabditis elek etkili hayvanlar bir kültür tabaktan başka bir hızlı sıralama, eşitleme, sağlık, işaretçileri etkilemeden temizlik sunan ve için aktarımlarına göstermek ve stres-indüklenebilir hareketliliği dahil olmak üzere gen gazetecilere. Bu erişilebilir ve yenilikçi araç C. elegans nüfusu korumak için hızlı, verimli ve olmayan stresli bir seçenektir.
Introduction
Yuvarlak solucan Caenorhabditis elegans, premier model organizmadır. Onların ekimi laboratuvarda basit ve kontrollü doğası, yanı sıra tüm onların genom sıralı1 ve her hücre gelişimsel kaderi2bilinir. Bu özellikleri nedeniyle, C. elegans genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan model bir organizmadır. Ancak, bu faydalı özellikleri ile birlikte bazı sorunlar için araştırmacılar geliyor. Onların hızlı oluşturma süresi nedeniyle C. elegans nüfus gıda dışında hızlı bir şekilde çalıştırabilirsiniz ve/veya nüfus birden çok nesiller ile karışık hale ve gelişim dönemleri aynı anda mevcut. Böylece, katı nematodunun büyüme ortamında (NGM) gerçekleştirilen deneyler bakteriyel gıda kaynak tüketir ve yeni larva geliştirmek önce hayvanlar taze tabakaları bana fiziksel olarak taşımak araştırmacılar gerektirir. Bir sık hayvanların aktarma çoluk çocuk nesiller ile karışık hale gelen deneysel örneğin alınma olasılığını önlemek için gerektiği şekilde bu sıkıcı olabilir. Yine de, bazı deneyler her iki çok sayıda hayvan ve genişletilmiş zaman puan (Örneğin, DNA veya RNA ayıklama erişkin dönemde) gerektirir. Bu doğru bir şekilde senkronize bir popülasyon sürdürmek ve hayvanlar çok sayıda aktarma sorunları bileşikleri.
C. elegans NGM üzerinde kültürlü aktarma geçerli yöntemleri seçmek veya hayvanlar tabak tabak yıkama; kimyasal tedavi hayvanlar (Örneğin, DNA çoğaltma inhibitörü fluorodeoxyuridine veya FUDR); ya da çok iyi plakaları hayvanlarda sıralamak için akış sitometresi kullanma. Malzeme çekme el ile tek tek veya birden çok hayvanlar3,4aktarmak için ince platin tel veya bir kirpik ile yapılan bir el araç kullanımını gerektirir. Bu yöntem doğru ama beceri ve zaman gerektirir ve çok sayıda hayvan içeren çalışmalar için bir kısıtlamadır. Mayıs da toplama bireyler doğal olmayan ve tutarsız miktarda bozukluğu ve kuvvet için potansiyel olarak subjecting tarafından fiziksel olarak zarar ve stresli hayvanlar için. Çamaşır bir arabellek çözüm ile bir kültür yemek durulama ve hayvanlar ile çözüm için yeni bir kültür plaka cam Pasteur pipet ile aktarma içerir. Bu yöntem hızlı ve etkili ama birden fazla nesiller ve hayvanların gelişim aşamalarında toplu olarak aktarılır olarak doğru değil. Kimyasal tedaviler, FUDR gibi herhangi bir DNA ikileşmesi ve böylece, gamet üretim ve yumurta gelişim engelleme yoluyla yavru önlemek için kodlamayla medya çözülmüş. Süre etkili, bu yöntem gelişimsel olgunlaşma sonra normal gelişim süreçleri bozmak değil olarak uygulanmış olması gerekir ve bu hala onun Yönetim3önce hayvanlar aktarmak için bir gereklilik olduğu anlamına gelir. Bu yöntem de yollar sinyal, hayvanlar üzerinde göze çarpan etkileri onlar yaş olarak sonuçlanan birden çok cep (Örneğin, bir ömrü uzatma veya değiştirilmiş bir proteostasis) kullanılan C. elegans 5suşu bağlı olarak etkiler, 6,7,8,9,10. Akış Sitometresi yöntemleri otomatik olarak sıralamak ve bireysel C. elegans bir çok iyi tabaktan başka bir11‘ e aktarın. Bu yöntem çok etkili ve verimli iken, akış sitometresi prohibitively pahalı ve pek çok araştırmacı için ulaşılmaz cihazıdır. Hayvanlar aktarma alternatif sıcaklık hassas sıcaklık ayarı12ile steril hale fer-15 ve fem-1, gibi mutant modelleri kullanmaktır. Mutant hayvanlar kullanarak bazı durumlarda yararlı olmakla birlikte, bu belirli suşları vahşi-türü hayvanlar daha yavaş büyür ve değiştirilmiş bir soykırım, eskime veya sağlıklı solucanlar için zavallı temsilcileri olarak hizmet veren güveniyor. Buna ek olarak, kısırlık ikna etmek için bir sıcaklık üst karakter üzerine güven aynı zamanda statik ortamı yokluğunda sonuçlar ve sıcaklık değişiklikleri kolayca gösterilmiştir gen ifadeleri13,14, etkilemek için 15. araştırma grupları daha önce teknikleri C. elegans boyutu16tarafından filtre uygulamak için bir kafes kullanımını açıklayan yayınlandı. Ancak, biz bu tür filtre kullanımı ile ilişkili olabilecek genel sağlık sonuçları herhangi bir değişiklik için test önceki iş bulmak koyamadık.
Böylece, çok sayıda hayvan kültür plakalar arasında aktarmak için ekonomik, verimli, hızlı ve doğru bir yöntem için C. elegans araştırma topluluk içinde bir ihtiyaç olduğunu. Biz ekipman ( Caenorhabditis elek olarak adlandırılır) ve onun üretim ve C. elegans araştırma topluluğu dizayn çalışması için ilişkili bir protokol bir geliştirilmiş, erişilebilir parça geliştirdik. Burada, tasarım Caenorhabditis elek ve yöntemlerin kullanımı için paylaştığımız ve biz kullanımı yaygın sağlık ya da herhangi bir stres işaretleri çift el ile malzeme çekme ve yaygın olarak kullanılan bir tedaviyle karşılaştırıldığında etki etmez göstermek, doğurganlık kısıtlama kimyasal FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, tasarım ve sıralama ve C. eleganssürdürmek için bir araç olarak kullanmak erişilebilir, etkili Caenorhabditis elek, tanıttı. Bu araç, bireysel hayvanlar, nüfus, kimyasal işlemler (Örneğin, FUDR) ve daha pahalı Yöntemler yavru hayvan yıkama el ile seçmek için çeşitli yararları vardır. İlk olarak, Caenorhabditis elek verimli ve hızlı bir şekilde büyük karışık nüfus (Tablo 2) hayvanların Döl (az 20 dk) sıralar. Ayrıca, aracın …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar çalışma tasarım ilk onun katkısı için Heather Currey ve Dr. Swarup Mitra el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Michael B. Harris Yorumlar, iyileştirme ve bu metodoloji gösteri üreten yardım için teşekkür etmek istiyorum. Suşları araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu yayında bildirilen araştırma tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaraları UL1GM118991, TL4GM118992 veya RL5GM118990 altında ve bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir)’tarafından desteklenmiştir Ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant sayı 5P20GM103395-15 altında. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. UA bir AA/EO işveren ve eğitim kurumu ve herhangi bir bireysel karşı yasadışı ayrımcılık yasaklar: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
