Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari

Il verme nematode Caenorhabditis elegans, è un organismo modello premier. Oltre la natura semplice e controllata della loro coltivazione in laboratorio, è loro intero genoma sequenziato¹ e il destino dello sviluppo di ogni cellula è noto². Grazie a queste caratteristiche, c. elegans è un organismo di modello ampiamente usato per gli studi genetici. Tuttavia, insieme con queste caratteristiche benefiche vengono alcune sfide per i ricercatori. A causa del loro tempo di generazione rapida, popolazioni di c. elegans possono rapidamente a corto di cibo e/o diventano popolazioni con più generazioni miste e stadi di sviluppo presentano in una sola volta. Così, gli esperimenti eseguiti su supporti di solida crescita del nematode (NGM) richiedono ricercatori spostare fisicamente gli animali in piatti freschi prima esaurisce la fonte alimentare batterica e nuove larve si sviluppano. Questo può essere noioso come un frequente trasferimento degli animali è necessaria per prevenire le popolazioni sperimentali da diventando mescolato con generazioni di prole. Ancora, alcuni esperimenti richiedono entrambi i grandi numeri di animali e punti di tempo prolungato (ad es., estrazione di DNA o RNA in età adulta). Questo composti le sfide di accuratamente mantenendo una popolazione sincronizzata e il trasferimento di grandi quantità di animali.

Attuali metodi di trasferimento di c. elegans coltivati su NGM sono picking o lavare gli animali da piastra a piastra; trattare chimicamente gli animali (per esempio, con il DNA replica inibitore fluorodeossiuridina o FUDR); o mediante citometria a flusso per ordinare gli animali in piastre multi-pozzetto. Picking prevede l’utilizzo di uno strumento a mano, realizzato con un sottile filo di platino o un ciglio, trasferire manualmente i singoli o più animali^3,4. Questo metodo è preciso ma richiede abilità e il tempo ed è una limitazione per gli studi che coinvolgono un numero elevato di animali. Picking maggio anche essere fisicamente dannosa e stressante per gli animali sottoponendo gli individui potenzialmente importi innaturali e incoerenti della dispersione e della forza. Lavaggio comporta una piastra di coltura con una soluzione tampone di risciacquo e trasferimento della soluzione con gli animali tramite vetro pipetta Pasteur di una nuova piastra di coltura. Questo metodo è rapido ed efficiente, ma non è accurato come più generazioni e stadi di sviluppo degli animali vengono trasferiti alla rinfusa. Trattamenti chimici, ad esempio FUDR, possono essere sciolto in coltura media per prevenire la produzione di prole attraverso il blocco di qualsiasi replica del DNA e quindi, lo sviluppo di uova e produzione di gameti. Mentre efficace, questo metodo deve essere applicato dopo la maturazione dello sviluppo per non interferire con i normali processi di sviluppo, e questo significa che c’è ancora un requisito per trasferire gli animali prima della sua amministrazione³. Questo metodo influisce anche più cellulari vie di segnalazione, con conseguente effetti notevoli sugli animali che invecchiano (ad esempio, un’estensione di durata della vita o un’alterata proteostasis) a seconda del ceppo di c. elegans utilizzato^{5, 6,7,8,9,10}. Il flusso cytometry metodi automaticamente ordinare e trasferire singoli c. elegans da una piastra multi-pozzetto per un altro¹¹. Mentre questo metodo è molto efficace ed efficiente, apparecchiatura di citometria a flusso è proibitivamente costosi e inaccessibili per molti ricercatori. Un’alternativa al trasferimento di animali consiste nell’utilizzare modelli di mutanti che sono termosensibili, quali fer-15 e fem-1, che diventano sterili con temperatura regolazione¹². Durante l’utilizzo di animali mutanti è utile in alcune situazioni, questi ceppi specifici crescono più lentamente rispetto agli animali wild type e fanno affidamento su un genoma alterato, che serve come poveri rappresentanti per invecchiamento o sani vermi. Inoltre, il ricorso a un cambiamento di temperatura per indurre sterilità risultati anche in assenza di un ambiente statico, e cambiamenti di temperatura sono state prontamente indicati per influenzare gene espressioni^{13,14, 15}. gruppi di ricerca sono pubblicati in precedenza tecniche che descrivono l’uso di una mesh per filtrare c. elegans di dimensioni¹⁶. Tuttavia, siamo riusciti a trovare un lavoro precedente test per eventuali modifiche negli esiti di salute globale che possono essere associati con l’uso di tali filtri.

C’è, così, un’esigenza di un metodo conveniente, efficiente, rapida e accurata per trasferire grandi quantità di animali tra piastre di coltura all’interno della comunità di ricerca di c. elegans . Abbiamo sviluppato un migliorato, accessibile pezzo di equipaggiamento (denominato il setaccio di Caenorhabditis ) e un protocollo associato per la fabbricazione e il suo funzionamento che soddisfa le esigenze della comunità di ricerca di c. elegans . Qui, condividiamo il design del setaccio di Caenorhabditis e metodi per il suo utilizzo, e dimostriamo che il suo utilizzo non influisce la salute comune o eventuali marcatori di stress rispetto alla raccolta manuale standard e un trattamento con il comunemente usati, limitare la fertilità chimica FUDR.