Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Die Nematoden Wurm Caenorhabditis Elegans, ist eine führende Modellorganismus. Neben der einfachen und kontrollierten Natur ihrer Züchtung im Labor ihre gesamte Genom sequenziert¹ und Entwicklungsstörungen Schicksal jeder Zelle ist bekannt². Aufgrund dieser Eigenschaften ist C. Elegans weit verbreiteten Modellorganismus für genetische Studien. Zusammen mit diesen vorteilhaften Eigenschaften kommen jedoch einige Herausforderungen für Forscher. Aufgrund ihrer schnellen Generationszeit C. Elegans Populationen können schnell laufen aus der Nahrung und/oder Populationen mit mehreren Generationen vermischt werden und Entwicklungsstadien auf einmal präsentieren. Folglich erfordern Experimente auf solide Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Forscher körperlich bewegen Tiere zu frischen Teller, bevor die bakterielle Nahrungsquelle erschöpft und neue Larven entwickeln. Dies kann mühsam sein, da eine häufige Übertragung der Tiere erforderlich ist, um zu verhindern, dass die experimentellen Populationen von mit Nachkommen Generationen vermischt. Jedoch erfordern einige Experimente sowohl große Anzahl von Tieren und längere Zeitpunkte (z.B. DNA oder RNA-Extraktion im Erwachsenenalter). Dies verstärkt die Entwicklung genau zu erhalten eine synchronisierte Bevölkerung und große Zahl von Tieren übertragen.

Aktuelle Methoden der Übertragung von C. Elegans kultiviert auf NGM Kommissionierung oder Waschen der Tiere von Platte zu Platte; chemische Behandlung der Tiere (z. B.mit der DNA-Replikation-Inhibitor Fluorodeoxyuridine oder FUDR); oder mittels Durchflusszytometrie, um die Tiere im Multi-well-Platten zu sortieren. Kommissionierung beinhaltet die Verwendung von ein Handwerkzeug, gemacht mit einer dünnen Platindraht oder eine Wimper manuell einzelne oder mehrere Tiere^3,4übertragen. Diese Methode ist korrekt, aber erfordert Geschick und Zeit und ist eine Einschränkung für Studien, die große Zahl von Tieren. Mai auch sein körperlich schädlichen und stressig für die Tiere durch potenziell Personen unnatürlich und inkonsistente Mengen von Störung und Kraft zu unterwerfen. Waschen umfasst Spülen einer Kulturschale mit einer Pufferlösung und die Lösung mit den Tieren über Glas Pasteurpipette auf eine neue Kultur-Platte zu übertragen. Diese Methode ist schnell und effizient aber ist nicht genau, wie mehrere Generationen und Entwicklungsstadien der Tiere in der Masse übertragen werden. Chemische Behandlungen, wie z. B. FUDR, können in die Kultivierung Medien, um zu verhindern, dass die Produktion von Nachkommen durch Sperrung DNA-Replikation, und somit die Gameten Produktion und Ei-Entwicklung aufgelöst werden. Während wirksam, nach Entwicklungsstörungen Reifung, nicht die normalen Entwicklungsprozesse stören diese Methode angewendet werden, und dies bedeutet, dass es noch eine Voraussetzung um die Tiere vor seine Verwaltung³zu übertragen. Diese Methode beeinflusst auch mehrere zelluläre Signalwege, die spürbare Auswirkungen auf die Tiere wenn sie älter werden (z.B., eine Lebensdauerverlängerung oder eine veränderte proteostase) abhängig von der Sorte von C. Elegans verwendet^{5, 6,7,8,9,10}. Flow Cytometry Methoden automatisch sortieren und individuelle C. Elegans aus einem Multi-well-Platte auf eine andere¹¹übertragen. Während diese Methode sehr effektiv und effizient ist, ist Flow Cytometry Ausrüstung unerschwinglich teuer und für viele Forscher nicht zugänglich. Eine Alternative zur Übertragung von Tieren soll mutierten Modelle verwenden, die sind temperaturempfindlich, z. B. Fer-15 und Fem-1, die steril mit Temperatur Einstellung¹²geworden. Verwendung von mutierten Tieren in einigen Situationen nützlich ist, diese spezifische Stämme wachsen langsamer als Wildtyp Tiere und sie verlassen sich auf eine veränderte Genom, als schlechte Vertreter für alternde oder gesunde Würmer. Darüber hinaus das Vertrauen auf eine temperaturverschiebung induzieren Sterilität führt auch das Fehlen von einer statischen Umgebung, und Temperaturschwankungen leicht nachweislich Einfluss auf Gen Ausdrücke^{13,14, 15}. Forschungsgruppen haben zuvor veröffentlichten Techniken beschreiben die Verwendung eines Netzes zum Filtern von C. Elegans nach Größe¹⁶. Jedoch konnten wir finden Vorarbeiten Tests für alle Änderungen an den allgemeinen Gesundheit Resultaten, die den Einsatz von solchen Filtern zugeordnet werden können.

So gibt es eine Notwendigkeit in C. Elegans Forschungskreisen eine kostengünstige, effiziente, schnelle und präzise Methode zur Übertragung von großen Anzahl von Tieren zwischen Kultur Platten. Wir haben eine verbesserte, zugängliche Stück Ausrüstung (benannt Caenorhabditis Sieb) und eine zugehörige Protokoll für seine Herstellung und Betrieb, die den Bedürfnissen der Forschungsgemeinschaft C. Elegans entwickelt. Hierin, teilen wir das Design der Caenorhabditis Sieb und Methoden für den Einsatz, und wir zeigen, dass ihre Verwendung nicht die allgemeine Gesundheit oder alle Stress-Marker im Vergleich zu standard manuellen Kommissionierung und eine Behandlung mit den gängigen auswirkt, Einschränkung der Fruchtbarkeit chemische FUDR.