Моделирование болезнь Шарко Мари зуб в пробирке Transfecting мышь первичной мотонейронов
Summary
Цель этой методики – подготовить высокообогащенного культуры первичной мотонейронов (MNs) из мышиных спинного мозга. Чтобы оценить последствия мутации, вызывая заболевания MN, мы опишем здесь изоляции эти изолированные MNs и их transfection magnetofection.
Abstract
Нейродегенеративные мотонейронов спинного мозга (MNs) причастны широкого спектра неврологических расстройств, включая боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб и спинальной мышечной атрофии, которые все связаны с мышечной атрофии. Основной культуры позвоночника МНБ использовали широко продемонстрировать участие конкретных генов в таких заболеваний и характеризуют сотовой последствия их мутаций. Эта культура модели первичной MN протокол производным от семенных работы Хендерсон и коллег более двадцати лет назад. Во-первых мы подробно метод рассечения передней рогах спинного мозга от зародыша мыши и изолировать MNs из соседних клеток, с использованием градиента плотности. Затем мы представляем новый способ эффективно transfecting MNs с плазмид выражение, с помощью magnetofection. Наконец мы показываем, как исправить и имунноконтраст первичной MNs. Использование neurofilament мутации, которые вызывают болезнь Шарко-Мари-зуб типа 2, этот протокол свидетельствует качественный подход к выражением протеинов интереса и изучение их участие в MN роста, техническое обслуживание и выживания.
Introduction
Нервно-мышечные заболевания охватывают разнообразные клинически и генетически различных патологий, которые характеризуются изменения мышц и нервной системы. Из-за достижения в области технологий виртуализации, сотни генов, ответственных за эти редкие заболевания были выявлены в ходе последнего десятилетия (список доступных в центре нейромышечные болезнь, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Разнообразие выявленных мутаций указывает, что различные мутации одного гена может привести к разному фенотипы и болезней1,2,3 и что мутации в различных генов может производить аналогичные фенотипов 4 , 5. в этом контексте, являются усилия по развитию сотовой модели, которые могут стать мощные инструменты для анализа последствий мутации и патологических механизмов.
Позвоночника MNs имеют большие СОСМ, расположенный в вентральной рогов спинного мозга, длинные аксоны форме скелетных мышечных волокон, и позволяют добровольных движений через освобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях. Так как MNs страдают от нервно-мышечных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб (CMT), и спинальной мышечной атрофии, д-р Хендерсон и коллеги разработали первый протокол6 , что позволило для выращивания в пробирке позвоночника MNs и открытие нейротрофических факторов GDNF7 (глиальных клеток производных нейротрофических факторов). Технические усовершенствования тех пор позволило для более точной очистки позвоночника MNs и их подтипы, использование СУИМ8, но обогащения градиент плотности остается мощным и широко используется в лабораториях, в настоящее время работает с основной позвоночника МНБ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Впоследствии, это также возможно для получения более высокого класса очистки MN через immunopanning, воспользовавшись поверхности маркер p75(НТР)15,16,17.
Спинной мозг содержит различные подтипы шейного, грудного и поясничного отдела МНБ, а также средний и боковые мотор столбцы, которые отличаются среди их расположение в передней рога на оси dorso вентральной и среди целей они иннервируют8, 18. основной MN культур можно восстановить все эти подтипы MN в физиологических пропорциях. Основным ограничением этой методики является низкое количество МНБ, полученные в конце процедуры; в самом деле можно ожидать, чтобы получить около 105 MNs из шести эмбрионов, которая подходит для микроскопии, но ограничения для биохимии экспериментов. Для выполнения экспериментов с более стандартизированной подтипы и обильные MNs (> 106 клеток), эмбриональных стволовых клеток, полученных MNs следует рассматривать18.
Трансфекция диких тип/мутант трансгенов или эндогенных генов нокдаун в первичной MNs является быстрый и полезный инструмент для расшифровки выкидышей пути, особенно когда мышь модели недоступны. Magnetofection является методика transfecting первичной нейронов, похож на липофекция без соответствующих нейротоксичности. Кроме того transfection может выполняться на зрелых нейронов после нескольких дней в пробирке, в отличие от методов, основанных на электропорации9. Однако один из недостатков этого метода является бисер привязать нуклеиновых кислот в культуре, вызывая шум в маркировке DAPI. Вирусная инфекция, вероятно, наиболее эффективным методом для transfecting МНС; Однако magnetofection не требует определенных процедур обеспечения безопасности, необходимые для вирусных производства и клеточных инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из критических точек в этот протокол является, что эмбрионов мыши разделяются на точное время окна во время разработки (E12.5), чтобы оптимизировать количество МНБ, полученные в конце. Кроме того для оптимальной урожайности, вскрытие должно выполняться утром или в начале второй поло…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить «Ассоциация le développement de la neurogénétique» доктор Жакье стипендий и AFM-Телетон за его поддержку через MyoNeurAlp стратегического плана. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Крис Хендерсон, д-р Уильям Camu, доктор Brigitte Pettmann, Raoul Седрик д-р и д-р Георг Haase, кто участвовал в развитии и совершенствовании техники и распространения их знаний.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
