Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting
Summary
Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.
Abstract
Neurodegeneratie van spinale motoneurons (MNs) is betrokken bij een groot spectrum van neurologische stoornissen zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth en spinale musculaire atrofie, die allen geassocieerd met atrofie van de spieren. Primaire culturen van spinale MNs zijn wijd gebruikt om blijk te geven van de betrokkenheid van specifieke genen in dergelijke ziekten en karakteriseren van de cellulaire gevolgen van hun mutaties. Dit protocol modellen een primaire MN cultuur is afgeleid van het baanbrekende werk van Henderson en collega’s meer dan twintig jaar geleden. Ten eerste, we detail een methode voor het ontleden van de voorste hoorns van het ruggenmerg van het embryo van een muis en het isoleren van de MNs van naburige cellen met behulp van een dichtheid verloop. Vervolgens presenteren we een nieuwe manier van efficiënt transfecting MNs met expressie plasmiden met behulp van magnetofection. Tot slot, we illustreren hoe op te lossen en immunokleuring primaire MNs. met behulp van neurofilament mutaties die leiden type 2 ziekte Charcot-Marie-Tooth tot, dit protocol toont aan een kwalitatieve benadering van uiten van proteïnen van belang en het bestuderen van hun betrokkenheid bij MN groei, onderhoud en overleving.
Introduction
Neuromusculaire ziekten omvatten een scala aan klinisch en genetisch verschillende aandoeningen die worden gekenmerkt door de verandering van de spier en/of het zenuwstelsel. Vanwege de vooruitgang in sequencing technologieën, honderden genen die verantwoordelijk zijn voor deze zeldzame aandoeningen zijn vastgesteld tijdens het laatste decennium (lijst beschikbaar op de neuromusculaire ziekte Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). De verscheidenheid van geïdentificeerde mutaties geeft aan dat er verschillende mutaties in een enkel gen leiden verschillende fenotypes en ziekten1,2,3 tot kunnen en dat mutaties in verschillende genen soortgelijke fenotypen kunnen produceren 4 , 5. in dit verband zijn er inspanningen voor de ontwikkeling van cellulaire modellen die krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van de gevolgen van de mutatie en pathologische mechanismen kunnen worden.
Spinale MNs hebben grote Soma gelegen in de ventrale hoorns van het ruggenmerg, formulier lange axons te richten skelet spiervezels en voor vrijwillige bewegingen door het vrijkomen van acetylcholine bij neuromusculaire kruisingen. Aangezien MNs worden beïnvloed door neuromusculaire ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT), en spinale musculaire atrofie, Dr Henderson en collega’s ontwikkelde de eerste protocol6 , dat is toegestaan voor de teelt van in vitro spinale MNs en de ontdekking van neurotrophic factor GDNF7 (gliale cel afgeleide neurotrophic factor). Technische verfijningen sindsdien hebben toegestaan voor nauwkeuriger zuivering van spinale MNs en de bijbehorende subtypen FACS8gebruikt, maar verrijking door dichtheid verloop blijft krachtige en meest gebruikte in laboratoria die momenteel werken met primaire spinale MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. vervolgens is het ook mogelijk te krijgen een hogere rang van MN zuivering door middel van immunopanning door gebruik te maken van oppervlakte marker p75(NTR)15,16,17.
Het ruggenmerg bevat verschillende subtypen van cervicale, thoracale en lumbale MNs, evenals met mediaan en lateraal motor kolommen die verschilt van de vindplaats in de voorste hoorn op een dorso-ventrale as en de doelen onderling innervate ze8, 18. primaire MN culturen kunnen herstellen alle van deze subtypen MN in fysiologische verhoudingen. De belangrijkste beperking van deze techniek is het geringe aantal MNs bekomen op het einde van de procedure; in feite, kan worden verwacht te verkrijgen rond 105 MNs zes embryo’s, die is geschikt voor microscopie maar voor Biochemie experimenten te beperken. Voor het uitvoeren van experimenten met meer gestandaardiseerde subtypen en overvloedige MNs (> 106 cellen), embryonale stamcel afkomstige MNs18moeten worden beschouwd.
De transfectie van wild-type/mutant transgenen of vechtpartij endogene genen in primaire MNs is een snelle en nuttig hulpmiddel voor het ontcijferen van de pathofysiologische trajecten, met name wanneer Muismodellen niet beschikbaar zijn. Magnetofection is een techniek voor transfecting primaire neuronen, vergelijkbaar met lipofection zonder de verwante neurotoxiciteit. Bovendien kan transfectie worden uitgevoerd op volwassen neuronen na verschillende dagen in vitro, in tegenstelling tot de technieken op basis van electroporation9. Een nadeel van deze techniek is echter dat de kralen nucleïnezuren in de cultuur binden, waardoor ruis in de DAPI labeling. Virale infectie is waarschijnlijk de meest efficiënte techniek voor transfecting MNs; magnetofection vereist echter geen bepaalde veiligheidsprocedures die nodig is voor virale productie en cellulaire infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eén van de kritieke punten in dit protocol is dat de muis embryo’s worden ontleed bij het venster van een precieze tijd tijdens de ontwikkeling (E12.5) voor het optimaliseren van de hoeveelheid MNs bekomen op het einde. Bovendien, voor optimale opbrengst, moet de dissectie worden uitgevoerd in de ochtend of vroeg in de middag. Voor E12.5 (bijvoorbeeld op E11.5) is dissectie moeilijk, vooral met betrekking tot de afschaffing van de hersenvliezen. Na E12.5 daalt het aantal verkregen MNs aanzienlijk. Om te control…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken de “Association pour le développement de la neurogénétique” voor Dr. Jacquier de fellowship en AFM-Telethon voor zijn steun via MyoNeurAlp strategisch plan. Wij zouden ook willen bedanken Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul en Dr. Georg Haase, die deelgenomen aan de ontwikkeling en verbetering van de techniek en de verspreiding van hun kennis.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
