Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone
Summary
Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.
Abstract
Neurodegeneration der spinalen Motoneurone (MNs) ist verwickelt in einem großen Spektrum von neurologischen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit und spinale Muskelatrophie, die Muskelatrophie zugeordnet sind. Primärkulturen von spinalen MNs haben verbreitet zu demonstrieren die Beteiligung bestimmter Gene in solchen Krankheiten und charakterisieren die zellulären folgen deren Mutationen. Dieses Protokoll Modelle eine primäre MN Kultur abgeleitet von der bahnbrechenden Arbeit von Henderson und Kollegen vor mehr als zwanzig Jahren. Zuerst zeigen wir eine Methode der sezieren die vorderen Hörner des Rückenmarks aus einem Maus-Embryo und MNs aus benachbarten Zellen mit einem Dichtegradienten zu isolieren. Dann präsentieren wir Ihnen eine neue Art des effizient transfecting MNs mit Ausdruck Plasmide mit Magnetofection. Schließlich zeigen wir, wie Sie zu beheben und Immunostain primäre zeigt MNs. mit Neurofilament-Mutationen, die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2 verursachen, dieses Protokoll einen qualitativen Ansatz, mit dem Ausdruck interessierender Proteine und studieren ihre Beteiligung an MN-Wachstum, Wartung und überleben.
Introduction
Neuromuskuläre Erkrankungen umfassen eine Vielzahl von klinisch und genetisch unterschiedlichen Pathologien, die durch die Veränderung von Muskel und/oder des Nervensystems gekennzeichnet sind. Aufgrund der Fortschritte in Sequenziertechnologien, Hunderte von Genen, die für diese seltenen Erkrankungen wurden während des letzten Jahrzehnts (Liste an Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Die Vielfalt der identifizierten Mutationen bedeutet, dass verschiedene Mutationen in einem einzelnen Gen verschiedene Phänotypen und Krankheiten1,2,3 verursachen können und Mutationen in verschiedenen Genen ähnliche Phänotypen erzeugen kann 4 , 5. in diesem Zusammenhang gibt es Bemühungen, zelluläre Modelle zu entwickeln, die leistungsfähige Werkzeuge für die Analyse von Mutation folgen und pathologischen Mechanismen werden kann.
Spinale MNs haben große Somas befindet sich in der ventralen Hörner des Rückenmarks, Form lange Axone Skelett-Muskelfasern und bewussten Bewegungen durch die Freisetzung von Acetylcholin an neuromuskulären Verbindungen ermöglichen. Da MNs von neuromuskulären Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung (CMT), betroffen sind und spinale Muskelatrophie, Dr. Henderson und Kollegen entwickelt das erste Protokoll6 , die für den Anbau von zulässig in-vitro- Wirbelsäule MNs und die Entdeckung von neurotrophen Faktor GDNF7 (Gliazelle abgeleiteten Neurotrophic Factor). Technische Raffinessen seitdem haben für eine genauere Reinigung von spinalen MNs und ihre Subtypen mit FACS8zugelassen, aber Anreicherung durch Dichtegradienten bleibt kräftig und weit verbreiteten im Labor arbeitet derzeit mit primärer spinaler MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. anschließend, es ist auch möglich, eine höhere Besoldungsgruppe von MN-Reinigung durch Immunopanning zu erhalten, unter Ausnutzung der Oberfläche Marker p75(NTR)15,16,17.
Das Rückenmark enthält verschiedene Subtypen des zervikalen, thorakalen und lumbalen MNs sowie mittlere und seitliche motor Spalten, die sich unter ihren Standort in der Vorderhornzellen auf einer Achse dorsal-Ventral unterscheiden und unter den Zielen sie innervieren8, 18. primäre MN Kulturen aller diese Subtypen MN in physiologischen Verhältnissen erholen können. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die geringe Anzahl von MNs erhalten am Ende des Verfahrens; in der Tat können voraussichtlich erhalten rund 105 MNs aus sechs Embryonen für Mikroskopie aber einschränkend für Biochemie Experimente geeignet ist. Experimente mit mehr standardisierte Subtypen und reichlich MNs durchführen (> 106 Zellen), embryonale Stammzellen abgeleitet MNs18betrachtet werden.
Transfektion von Wild-Typ/Mutant transgene oder Knockdown endogene Gene in primären MNs ist ein schnelles und hilfreiches Werkzeug für die Entschlüsselung pathophysiologischen Wege, vor allem, wenn Maus-Modellen nicht zur Verfügung stehen. Magnetofection ist eine Technik für transfecting primären Neuronen, ähnlich wie Lipofektion ohne die damit verbundenen Neurotoxizität. Darüber hinaus kann Transfektion auf Reife Neuronen nach mehreren Tagen in Vitro, im Gegensatz zu Techniken basierend auf Elektroporation9durchgeführt werden. Ein Nachteil dieser Technik ist jedoch, dass die Perlen in der Kultur, Lärm in DAPI-labeling Nukleinsäuren binden. Virale Infektion ist wahrscheinlich die effizienteste Technik für transfecting MNs; Magnetofection erfordert jedoch keine bestimmte Sicherheitsvorkehrungen für virale Produktions- und zelluläre Infektion benötigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischen Punkte in diesem Protokoll gehört, dass die Maus-Embryonen bei einem genauen Zeitfenster während der Entwicklung (E12.5), die Höhe der MNs erhalten am Ende zu optimieren seziert werden. Darüber hinaus sollte für optimalen Ertrag der Dissektion am Morgen oder in den frühen Nachmittag durchgeführt werden. Vor E12.5 (z. B. bei E11.5) ist Dissektion schwierig, insbesondere im Hinblick auf die Beseitigung von der Hirnhaut. Nach E12.5 sinkt die Anzahl der erhaltenen MNs deutlich. Um den Embryosta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken, der “Association pour le Développement De La Neurogénétique” für Dr. Jacquier Fellowship und AFM-Telethon für seine Unterstützung durch MyoNeurAlp Strategieplan. Wir möchten auch danke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul und Dr. Georg Haase, die bei der Entwicklung und Verbesserung der Technik teilgenommen und ihr Wissen zu verbreiten.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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