Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse
Summary
L’obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l’isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.
Abstract
Neurodegenerazione dei motoneuroni spinali (MNs) è implicata in un ampio spettro di disturbi neurologici, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscolare spinale, che sono tutti associati ad atrofia muscolare. Colture primarie di MNs spinale sono stati utilizzati ampiamente per dimostrare il coinvolgimento di geni specifici in tali malattie e caratterizzare le conseguenze cellulari delle loro mutazioni. Questa cultura di modelli un MN primario del protocollo derivato dal lavoro seminale di Henderson e colleghi più di venti anni fa. In primo luogo, abbiamo un metodo di dissezione corni anteriori del midollo spinale da un embrione di topo e isolando il MNs da cellule utilizzando un gradiente di densità vicine in dettaglio. Quindi, vi presentiamo un nuovo modo di trasfezione in modo efficiente MNs con plasmidi di espressione utilizzando magnetofection. Infine, illustriamo come risolvere e immunostain primaria che MNS. utilizzando mutazioni di neurofilament che causano la malattia di Charcot-Marie-Tooth, tipo 2, questo protocollo dimostra un approccio qualitativo che esprimono le proteine di interesse e studiare il loro coinvolgimento nella Crescita di MN, la manutenzione e la sopravvivenza.
Introduction
Malattie neuromuscolari comprendono una varietà di patologie clinicamente e geneticamente distinte che si caratterizzano per l’alterazione del muscolo e/o il sistema nervoso. A causa dei progressi nelle tecnologie di sequenziamento, centinaia di geni responsabili di questi disordini rari è stati identificati durante l’ultimo decennio (elenco disponibile presso il centro di malattie neuromuscolari, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La varietà di mutazioni identificate indica che mutazioni differenti in un singolo gene possono causare diversi fenotipi e malattie1,2,3 e che mutazioni in geni differenti possono produrre fenotipi simili 4 , 5. in questo contesto, ci sono gli sforzi per sviluppare modelli cellulari che possono diventare potenti strumenti per analizzare le conseguenze di mutazione e meccanismi patologici.
MNs spinale hanno grande somas situato nelle corna ventrale del midollo spinale, gli assoni lunghi forma come target fibre muscolari scheletriche e consentire movimenti volontari attraverso il rilascio di acetilcolina alle giunzioni neuromuscolari. Poiché MNs sono colpiti da malattie neuromuscolari come la sclerosi laterale amiotrofica, la malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) e l’atrofia muscolare spinale, Dr. Henderson e colleghi ha sviluppato il primo protocollo n.6 che ha permesso per la coltivazione di in vitro spinale MNs e la scoperta di neurotrophic factor GDNF7 (fattore neurotrophic derivato delle cellule gliali). Raffinatezze tecniche da allora hanno consentito una più accurata purificazione di MNs spinale e relativi sottotipi usando FACS8, ma arricchimento mediante gradiente di densità rimane potente e ampiamente utilizzati nei laboratori attualmente lavorando con MNs spinale primaria 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. successivamente, è anche possibile ottenere un grado di purificazione MN superiore attraverso immunopanning, approfittando di superficie dell’indicatore p75(NTR)15,16,17.
Il midollo spinale contiene diversi sottotipi di MNs cervicale, toracica e lombare, nonché colonne motore mediani e laterali che differiscono tra loro posizione nel corno anteriore su un asse dorso-ventrale e tra i bersagli innervate8, 18. culture MN primario possono recuperare tutti questi sottotipi di MN in proporzioni fisiologiche. Il limite principale di questa tecnica è il basso numero di MNs ottenuti al termine della procedura; in realtà, ci si attende di ottenere circa 105 MNs da sei embrioni, che è adatto per la microscopia ma limitante per esperimenti di biochimica. Per eseguire esperimenti con più standardizzati sottotipi e MNs abbondanti (> 106 cellule), embrionale MNs derivati da cellule staminali dovrebbe essere considerato18.
Transfezione di selvaggio-tipo/mutante transgeni o atterramento geni endogeni nelle primarie MNs è uno strumento rapido e utile per decifrare le vie fisiopatologiche, soprattutto quando non sono disponibili modelli murini. Magnetofection è una tecnica per trasfezione neuroni primari, simili a lipofezione senza la neurotossicità correlata. Inoltre, la transfezione può essere eseguita su neuroni maturi dopo diversi giorni in vitro, a differenza di tecniche basate su elettroporazione9. Tuttavia, uno svantaggio di questa tecnica è che le perle si legano gli acidi nucleici nella cultura, causando rumore in DAPI etichettatura. Infezione virale è probabilmente la tecnica più efficiente per trasfezione MNs; Tuttavia, magnetofection non richiede determinate procedure di sicurezza necessarie per la produzione virale e infezione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno dei punti critici di questo protocollo è che gli embrioni del mouse vengono sezionati in una finestra di tempo preciso durante lo sviluppo (12.5) per ottimizzare la quantità di MNs ottenuti alla fine. Inoltre, per una resa ottimale, la dissezione deve essere eseguita al mattino o nel primo pomeriggio. Prima 12.5 (ad es., a E11.5), la dissezione è difficile, soprattutto per quanto riguarda l’eliminazione delle meningi. Dopo 12.5, il numero di MNs ottenuti scende significativamente. Per controllare la fase …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la “Association pour le développement de la neurogénétique” del Dr. Jacquier fellowship e AFM-Telethon per il suo sostegno attraverso il piano strategico MyoNeurAlp. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, che hanno partecipato a sviluppare e migliorare la tecnica e diffondere la loro conoscenza.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
