Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

Todos os experimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as orientações contidas dentro do Reino Unido animais (procedimentos científicos) Act de 1986 e foram aprovados pelo bem-estar dos animais da Universidade de Belfast e corpo de revisão ética da rainha. 1. isolamento de arteríolas retina Nota: O seguinte protocolo é usado para isolar as arteríolas da retina. Este método é otimizado para as arteríolas retina do rato, mas pode ser usado com retinas de rato. O rendimento dos navios, no entanto, é inferior ao usar ratos. Compõem uma solução de baixo Ca2 + contendo Hanks (LCH), conforme mostrado na tabela 1.Nota: Esta solução pode ser armazenada por até 3 dias a 4 ° C (quando usando armazenados LCH, certifique-se de que ele se equilibra a temperatura e o pH está correto antes de usar). Montar o seguinte equipamento antes da coleta de tecido para garantir rápida microdissection de retinas: serrilhada, pinça, tesoura curva, lâmina de prato (prato de Petri do silicone revestido), único gume de dissecação, 2 conjuntos de 1 copo (sem corte) de fórceps pipeta Pasteur (fogo polido para uma ponta suave mas não estreita), 1 pipeta descartável de plástico (com ponta aparada para aumentar a abertura para ~ 5-7 mm), 1 vidro redondo fundo tubo de ensaio (5 mL) e titular. Decantar cerca de 50 mL de LCH para um copo de vidro e preparar um segundo copo para decantar os resíduos líquidos.Nota: Consulte a Tabela de materiais para as especificações e detalhes do fabricante. Eutanásia o rato usando CO2 , seguido por punção cardíaca para extrair sangue (evitar deslocamento cervical ou concussão, porque podem danificar os vasos sanguíneos no olho). Retrair as pálpebras com fórceps serrilhado e, em seguida, usar a tesoura curva para corte em torno dos músculos orbitais e através do nervo óptico. Delicadamente, extrai os olhos da órbita tendo o cuidado de cortar os restantes anexos com uma tesoura. Coloque os olhos imergidos em solução LCH sobre o prato de dissecação (olhos podem ser transportados no gelo em uma solução de LCH se necessário). Usar um conjunto de pinças contundente para ancorar o olho para o prato, segurando os ligamentos musculares orbital ou nervo óptico; Certifique-se de que o ponto de ancoragem é tão próximo quanto possível da esclera para estabilizar o olho. Usando a lâmina, corte através da córnea ao longo da ora serrata e remova a lente pressionando suavemente a esclera com fórceps. Corte o copo de olho na metade simetricamente através do disco óptico. Usando fechado fórceps suavemente ‘escova’ fora as retinas das duas metades da viseira, tendo o cuidado de remover quaisquer anexos restantes para o disco óptico. Repita o processo com o segundo olho e transferir as retinas dissecadas para o tubo de ensaio utilizando que a pipeta de plástico e uma pequena gota de médio LCH. Usando a pipeta plástica encher o tubo de ensaio com LCH para ~ 5ml e permitir que as retinas resolver ao fundo. Lave o tecido aproximadamente 3 vezes removendo ~ 4 mL da solução do tubo e adicionando LCH fresco com a pipeta de plástico. Se necessário, remova o tecido estranho como ligamentos suspensory, humor vítreo e pelos. Lave o interior do vidro pipeta Pasteur (ponta polida) com LCH para evitar que o tecido grude para a pipeta. Com a mesma pipeta, remova aproximadamente 4 mL de solução de tubo de ensaio. Em seguida, adicione cerca de 2 mL de fresco LCH. Separe delicadamente (triture) as retinas desenhando o tecido pela ponta do vidro Pipetar lentamente e expelir o conteúdo em tubo de ensaio. Note, não tente introduzir bolhas nesta fase. Repita a etapa 1.10 até as retinas são divididas para um tamanho de aproximadamente 2-3 mm2. Lave o interior da pipeta com cerca de 2 mL de LCH e expulsar esta em tubo de ensaio. Permitir que o conteúdo resolver a parte inferior mais 5-10 min. Repita o processo de trituração, conforme descrito em 1.10-1.12 com força um pouco mais até que os pedaços de tecido são aproximadamente 1 mm2 no tamanho. Mais uma vez, permitir que o tecido se contentar com 5-10 min. Repita os passos de 1.10-1.12 uma terceira vez com mais força até que os conteúdos são totalmente homogeneizados e permanecem sem pedaços da retina (a solução deve tornar-se leitoso na aparência).Nota: Esta técnica produzirá até 8 segmentos de arteriolare (relativamente livres da envolvente neuropile e com alguns ramos permanecem intactos) por isolamento medindo 8-45 µm de diâmetro e 200-2500 µm de comprimento. Transferir uma pequena quantidade da amostra isolada em uma câmara de gravação fisiológicos ou adicionar corantes fluorescentes para medição de Ca2 + concentração intracelular ([Ca2 +]i; ver secção 3). Descarte de restos de eye copos e solução removida durante o processo de isolamento, em conformidade com as regras locais no tratamento de resíduos animais.Nota: Enquanto é aconselhável experimentar em vasos imediatamente após o isolamento, isolado de excedentes pode ser armazenado a 4 ° C por até 8 h. 2. arteriolar pressão miografia Nota: A pressão Arteriolar miografia é realizado da seguinte forma usando equipamento detalhado na figura 1A, B e a Tabela de materiais. Transferir uma alíquota do vaso retinal homogeneizado (1-2 mL; isolado de acordo com o ponto 1) para uma câmara de gravação fisiológicos (parcialmente preenchido com nominalmente solução de Ca2 +grátis Hanks; 0Ca2 + Hanks’; ver tabela 1) montado no palco de um microscópio invertido. Deixe os vasos para acertar na parte inferior da câmara de gravação pelo menos 5 min antes da experimentação. Visualmente de varredura ao longo da câmara de gravação para identificar arteríolas > 200 µm de comprimento e possuindo uma extremidade aberta através da qual a embarcação pode ser canulada (identificação do tipo de navio é mais explorada na seção de resultados). Posição do navio no centro do campo de visão. Se nenhum navios apropriados estão presentes, transferi outra aliquota do navio homogeneizado na câmara de gravação conforme passo 2.1. Ancorar uma extremidade do vaso usando pinça fina e um deslize de fio de tungstênio pequeno (75 µm de diâmetro e ~ 2-4 mm de comprimento) colocado sobre o navio (veja a Figura 1(i)). Para fazer isso Segure o fio na pinça e localize o fórceps acima da câmara de gravação. Identificar a sombra correspondente da pinça sob o microscópio, baixe o fórceps para o banho até o fio se torna aparente. Posicione o fio sobre o navio aproximadamente 200 µm de extremidade aberta e soltar o fio perpendicular ao eixo longo do navio.Nota: O peso do fio de tungstênio é suficiente para ocluir o vaso distal interromper o fluxo de conteúdo luminal durante a canulação e pressurização. Mover a arteríola em uma posição apropriada dentro da câmara de gravação tais que encontra-se horizontalmente através do banho com a extremidade aberta, em consonância com a cânula de pressurização (ver Figura 1(ii-iv)). Para fazer isso, empurrando suavemente o deslizamento de fio de tungstênio oclusão com uma seção adicional do fio realizada dentro da pinça; Não toque a arteríola como irá aderir irreversivelmente para a pinça. Sempre que necessário (para segmentos de arteríola longo), adicionar deslizamentos de fio de tungstênio adicionais sobre o navio tal que a distância entre as extremidades obscurecidas e abertas do navio é não mais do que 200 µm; Isto ajuda a prevenir a arteríola movendo-se fora do campo de visão em cima de pressurização. Se o navio tiver qualquer ramos laterais, estes também devem ser ocluídas com deslizamentos de fio de tungstênio adicionais. Se um ramo lateral não pode ser obstruído descarte o navio. Perfundir a câmara com 0Ca2 + Hanks a 37 ° C para remover o tecido da retina estranho e para aquecer o banho para temperaturas fisiológicas.Nota: Um sistema de aquecedor de perfusão e em linha de banho padrão de gravidade-alimentado pode ser usado para esta finalidade (ver figura 1A). 0Ca2 + Hanks’ é usado para facilitar o procedimento de cateterização, desde a remoção da autoridade de certificação externa2 + garante que as arteríolas permanecem dilatadas. Fabricar cânulas de pressurização dos capilares de vidro de borosilicato filamentado (ponta diâmetro ~ 3-10 µm, dependendo do diâmetro do vaso a ser canulada; embarcações menores exigem mais estreitas cânulas; consulte a Tabela de materiais) usando um extrator de microeletrodos e volta-preenchimento com solução 0Ca2 + Hanks. Certifique-se que a haste da cânula é afilada suavemente em direcção à ponta para facilitar a cateterização. Montar a cânula em um suporte de pipeta anexado a uma seringa de 10 mL, através de um conector em Y e uma torneira de 3 vias; Isto é usado para pressurizar o sistema, sendo gravado usando um manómetro ligado para o outro lado-braço do Y-conector de pressão (ver figura 1B).Nota: Uma pipeta de ‘auxiliar’ é necessário para ajudar o processo de canulação. Fabricar a pipeta de um capilar de vidro borosilicato apontou um puxador de microeletrodos para um diâmetro de ponta de 0,5 – 2 µm. fortemente fogo polonês a pipeta (muitas vezes até fechado) usando um microforge. Cuidadosamente coloque a pipeta de auxiliar perpendicularmente ao eixo longo do navio perto de extremidade aberta usando um manipulador de 3 eixos mecânico (ver Figura 1). Posicione a pipeta auxiliar logo acima do navio, mas não tocar isso. Posicionar a pipeta de canulação na extremidade aberta do navio (veja a Figura 1 e 2A(i)) usando um micromanipulador bem; Posicione a ponta imediatamente adjacente à abertura, avaliada ajustando o plano de foco no microscópio (a 20 X). Quando ambos o fim do navio e a ponta da cânula está em foco ao mesmo tempo a cânula está corretamente posicionada para canulação (ver Figura 2A(ii)). Avançar a cânula de pressurização para a abertura do vaso usando os controles de eixo x do micromanipulador bem (ver Figura 2A(iii)). Avalie o sucesso da canulação movendo a cânula ao longo do eixo y. Se a cânula permanece dentro do navio é canulado com sucesso (veja a Figura 2A(iv)). Se a cânula se move fora do navio, a cânula é susceptível de ser acima do navio; caso afirmativo repeti passo 2.10-2.11 com a cânula em um plano inferior no eixo z. Mediante canulação bem-sucedida Desça cuidadosamente a pipeta de auxiliar a bordo do navio para reprimir a arteríola. Guia da parede arteriolar sobre a cânula de pressurização com a pipeta de auxiliar, ao mesmo tempo como a pipeta de canulação é avançada mais no lúmen da embarcação a uma distância de aproximadamente 30-50 µm (ver Figura 2A(v, vi)).Nota: Este procedimento requer movimento simultâneo, controlado de ambos manipulators (pipeta auxiliar se movendo em direção a cânula, enquanto a cânula se move para o lúmen da embarcação) e exigirá prática extensiva para alcançar uma elevada taxa de sucesso. Altere a solução do banho para Hanks normal contendo 2 mM Ca2 + (ver tabela 1) a 37 ° C. Normalmente, isso provoca um ligeiro estreitamento a arteríola e a formação de um selo apertado à volta da cânula de pressurização. A pipeta de auxiliar então pode ser movida longe do navio. Permitir que um selo apertado desenvolver durante 15 min. ver o vaso utilizando uma câmera USB (e software de aquisição de imagem) anexado ao microscópio e ajustar o foco para maximizar o contraste entre os limites do navio e os espaços externos e intraluminal (ver Figura 2B). Imagem do navio no 0,5 – 5 frames/s. Após 1 min de gravação no 0 mmHg, aumentar a pressão intraluminal até o nível desejado, fechando a torneira de 3 vias ligada à cânula de pressurização (ver figura 1B) e aplique uma pequena quantidade de pressão positiva ao sistema através da seringa. Observe a pressão alterar no manómetro.Nota: Pressão pode ser adicionado de forma sábia passo até 100 mmHg ou a um valor por exemplo 40 mmHg (aproximando-se da retina pressão arteriolar na vivo)23. O navio deve rapidamente dilatar confirmando sucesso canulação. Por favor note, vasoconstrição induzida por pressão (ou seja, a resposta miogênico) posteriormente irá desenvolver ao longo de um período de 15 min, mas por causa do pequeno tamanho desses navios, este não pode sempre ser visualmente detectável. Monitore cuidadosamente o navio durante a pressurização inicial para vazamentos óbvios. Fontes de vazamento podem se originar de ramos laterais entalhadas ou selagem inadequada da cânula no interior da arteríola. Relógio para conteúdo intraluminal, deixando o navio. Menores, menos óbvios vazamentos podem tornar-se aparente ao longo do tempo como uma queda na pressão no manómetro. Se possível, obstrua a abertura com deslizamentos de fio de tungstênio adicional tomando cuidado para não perturbar a cânula. Exclua preparações com escapamento óbvia de uma análise mais aprofundada. Aplicar a droga de interesse abluminally o vaso antes de, ou seguinte, pressurização de 15 min, dependendo dos objectivos do experimento (a primeira permite que efeitos sobre o desenvolvimento do tônus miogênico para ser determinado, enquanto o último permite a análise dos efeitos em Tom miogênico de estado estacionário). Um sistema de entrega de drogas típico é retratado na Figura 3A. Posicione a tomada de entrega perpendicular à parte do navio de interesse (conforme ilustrado na Figura 1), a uma distância ~ 500 µm longe do navio de interesse, tendo o cuidado de garantir que a saída é otimamente angulado para totalmente superfuse a área (ver Figura 3B). Certifique-se de que alterações na perfusão não perturbe fisicamente o navio. Após a conclusão de um experimento, aplique uma solução de 0Ca2 + Hanks’ contendo 10 µM wortmannin (inibidor de quinase de cadeia leve de miosina) para màxima dilate o vaso para determinar o diâmetro passivo.Nota: A força do selo canulação pode ser testada no final do experimento, elevando a pressão intraluminal de > 100 mmHg. A maioria dos navios permanecerá presa mesmo com essa alta pressão indicando um selo apertado. Realizar análise off-line usando detecção de bordas para controlar as alterações no diâmetro arteriolar (ver Tabela de materiais para o software sugerido). Normalize o diâmetro da arteríola ao diâmetro do passivo para comparação entre os vasos. 3. Ca2 + imagens Nota: Arteríolas retina isoladas estão preparadas para convencional (microfluorimetry) e confocal Ca2 + imagem como segue (usando equipamento detalhado na Tabela de materiais). Prepare homogenates da retina em um tubo de ensaio de vidro de 5 mL, conforme descrito na seção 1. A 1 mL de retina homogenate adicionar Fura-02:00 (microfluormetric Ca2 + gravação) ou Fluo-04:00 (confocal Ca2 + imagem) para dar uma concentração final de 5 µM (proteger da luz); indicadores de tintura preferencialmente carreguem em células musculares lisas. Manter à temperatura ambiente no escuro por 2 h, passando rapidamente do lado do tubo a cada 15-20 min para re-suspender o tecido da retina. Depois disso, dilua o homogenate 1:4 com solução LCH para reduzir ainda mais tintura de carregamento.Nota: Os navios permanecem viáveis por até 6 h (quando armazenadas a 4 ° C e no escuro); no entanto é recomendável que as experiências são iniciadas logo que possível para reduzir o impacto da compartimentalização do corante em organelas internas ou extrusão do corante ao longo do tempo. Transferi 1-2 mL de retina homogeneizado para uma câmara de gravação com fundo de vidro (parcialmente preenchida com LCH) montada no palco de um microscópio invertido, conectado a um sistema de microscopia confocal ou Ca2 + microfluorimetry. Ancorar arteríolas perpendiculares à direção do fluxo através da câmara de gravação, com deslizamentos de fio de tungstênio (50 µm de diâmetro, 2-4 mm de comprimento) espaçada ~ 100-200 µm separados ao longo do comprimento do navio (ver Figura 3) usando uma técnica semelhante ao descrito na etapa 2.3. Perfundir o banho com solução normal Ca2 + Hanks a 37 ° C. Posição tomada de entrega de drogas, como retratado na Figura 3 e aplicar drogas aos navios, conforme descrito na etapa 2.17. Para convencional Ca2 + tratamento de imagens, iluminar o navio com luz de 340/380 nm através de um objectivo de imersão UV de óleo (por exemplo, 100 X, at 1.3) e recolher a fluorescência emitida em 510 nm, através de um fóton contando tubo fotomultiplicador (PMT). No final de cada experimento, medir a fluorescência de fundo por extinguendo o vaso com uma solução contendo MnCl (ver tabela 1). Usar rácios de fluorescência fundo-corrigido (R-F340/F380) para análise ou converter para intracelular Ca2 + ([Ca2 +]i) usando Rmin emáx medições de R (ver tabela 1; aplicado antes da têmpera 24) e a equação de Grynkiewicz25. Para confocal Ca2 + tratamento de imagens, excitar os navios carregados de Fluo-4 em 488 nm e capturar as emissões de fluorescência resultante em 490-535 nm em qualquer linha de digitalizar modo (xt) ou modos de varredura xyt (512 x 512 pixels; sugerido pinhole 300 nm). Normalizar as medições para a fluorescência gravado no tempo t = 0s (F/F0). Avalie as alterações em [Ca2 +]i durante aplicações de drogas ou pressurização off-line em determinadas regiões de interesse (ROIs) usando software de análise de imagem. Se necessário, execute Ca2 + imagem com pressão miografia.Nota: As descrições acima foram otimizadas para navios não pressurizados; no entanto, é possível combinar Ca2 + imagem com pressão miografia como segue. Isole as arteríolas conforme seção 1. Carregar com Ca2 + indicador corantes como por passo 3.1-3.2. As arteríolas de transferência para a câmara de gravação e Canule acordo com o ponto 2. Tome cuidado para limitar a exposição à luz durante o procedimento de montagem. Medir Ca2 + conforme passo 3.5 ou 3.7 acima. Pressurizar o navio e repita a medição de Ca2 +. Medição simultânea do diâmetro do vaso é dependente do modo de medição de Ca2 + e equipamentos utilizados.Nota: Para confocal Ca2 + medição pode ser necessário a imagem regiões separadas pré e pós-pressurização devido ao descoramento do corante durante longas exposições à luz. 4. Patch-Clamp eletrofisiologia Nota: A gravação de células inteiras e single-channel é possível de células de músculo de liso arteriolar individuais ainda incorporadas dentro de suas arteríolas do pai da seguinte maneira (usando equipamento detalhado na Tabela de materiais). Isolar e ancorar arteríolas retina na câmara de gravação, como descrito nos passos 1, 2,3 e 3,3. Para a gravação da remendo-braçadeira, o fio de tungstênio deslizamentos são espaçados 200-800 µm separados ao longo do navio. Remover a lâmina basal em torno da arteríola e desacoplar eletricamente as células adjacentes de músculo liso e células endoteliais subjacentes antes da fixação do remendo. Para fazer isso, superfuse o navio com uma série sequencial de soluções de enzima (tabela 1) a 37 ° C durante o período necessário.Nota: A duração da exposição de enzima é otimizada para as arteríolas retina do rato (protease, ~ 8 min; colagenase, ~ 12 min) e depende da taxa de fluxo do sistema de entrega de droga (~ 1 mL/min na nossa configuração) e as atividades da unidade do lote de enzimas sendo usado. Avaliar o nível de digestão na separação visual de endotelial e camadas de músculo liso durante a colagenase passo como mostrado na Figura 4. Uma vez que a separação entre as camadas de células é observada (como mostrado na Figura 4B), aplicar DNAse eu solução (~ 4 min) então encerrar a digestão por substituição da solução de banho com solução normal Ca2 + Hanks. Remova quaisquer fios restantes da lâmina basal e/ou periférica neuropile varrendo cuidadosamente as pontas fechadas de pinça fina ao longo da superfície do navio. Puxe e polonês capilares de vidro (Tabela de materiais), encha-a com solução de pipeta (tabela 1) e coloque firmemente no suporte do headstage remendo-braçadeira pipeta. Posição da pipeta em um ângulo de 45° em relação à câmara de gravação e avançá-lo para o navio usando a configuração de grosseira em um micromanipulador motorizado. Selecione uma célula de músculo liso, saliente da parede do vaso e cuja a superfície é livre de sujidade visível (veja Figura 4B). Posicione a ponta da pipeta remendo verticalmente sobre a célula de interesse e diminuir gradualmente, usando o movimento fino/lento do micromanipulador para fazer contato com a membrana do músculo liso. Avaliar o contato entre a célula e pipeta visualmente do movimento da célula e uma mudança na resistência pipeta medida usando o protocolo do teste de membrana (selo) do software de aquisição (passo negativo de 5-10 mV de 0 mV, frequência de 25 KHz; ver Figura 5A(i)) . Quando aumentou a resistência do selo 5-fold (por exemplo, passando de 2 para 10 MΩ; Figura 5A (ii)) Aplique pressão negativa transitoriamente na parte de trás do titular da pipeta através de um conector em y, torneira de 3 vias, seringa e tubos ligados ao titular da pipeta (montado em uma maneira similar ao usado na pressurização de arteríolas, ver figura 1B). Repita aplicações de pressão negativa até um gigaseal (> 1 resistência GΩ; conforme indicado pelo teste do software de aquisição de membrana) é formado (Figura 5A(iii)). Note que este processo pode demorar de 1 a 5 min. Se um gigaseal não forma, escolha uma célula diferente a braçadeira do remendo usando uma pipeta de remendo fresco. Aplica uma exploração potencial à célula através do software de aquisição conforme o experimento sendo executado (normalmente 0, -40 ou -80 mV). Estudar a atividade de canal único (na célula) na configuração do presente. Alternativamente, gere patches de dentro para fora rapidamente, retraindo a pipeta de remendo de superfície celular após a formação de gigaseal. Como as extremidades livres da membrana podem re-anneal nestas condições retire a pipeta do banho através de rápido movimento vertical do manipulator (Ajuste grosseiro). Rapidamente retorne através do menisco para remover a membrana reformada, deixando apenas o patch para dentro a ponta da pipeta. Definir a frequência de amostragem sobre o software de aquisição a 5kHz e activar o modo de gravação contínua, a atividade de registro de canal. Aplica quaisquer alterações de tensões, se necessário através do software ou do amplificador. Se necessário, aplica drogas para patch de navio/membrana conforme descrito na etapa 2.17. Se o estiramento da membrana é necessário, aplique pressão negativa para a parte posterior da pipeta usando a seringa anexada a um manómetro através de uma torneira de 3 vias e derivação. Analise as gravações de único canal para probabilidade aberta e condutância unitária, em conformidade com os procedimentos padrão26. Para toda célula atual gravação pull e polonês pipetas conforme a Tabela de materiais, encher com solução de pipeta contendo anfotericina B (adicionar 3 mg de anfotericina B para 50 µ l de DMSO; adicionar 3-6 µ l isto a 1 mL de solução de células inteiras pipeta; proceda à sonicação para misturar) e formar um selo como por etapas 4.6-4.9. Devido à inclusão de anfotericina B não há nenhuma necessidade de romper a membrana dentro a ponta da pipeta para acessar a célula inteira. Monitorar o acesso, que será adquirido aos poucos, usando o protocolo do teste de membrana do software de aquisição (etapa de mV-20-40 mV, frequência de amostra 25 KHz; ver Figura 5B). Instalação automatizada de capacitivas transientes em algum software produz medições em tempo real de acesso resistência e capacitância de célula (Alternativamente o declínio relativo dos transientes pode ser avaliado pelo olho). Uma vez que a resistência de acesso cai para < 15 MΩ, realize as compensações de resistência de série (Figura 5) usando os mostradores de parâmetro de células inteiras (resistência série e capacitância) do amplificador. Para fazer isso, use os valores de montagem automatizada para definir inicialmente os mostradores (consulte a Figura 5(ii)), em seguida, aumentar o mostrador de compensação de resistência série (previsão e correção se disponível do amplificador) re-ajustar as compensações de toda célula reduzindo a corrente capacitiva (consulte a Figura 5(iii)). Tomando cuidado para não mais de compensar (como mostrado na Figura 5(iv)). Normalmente, é possível compensar a resistência série com 75% em modo patch perfurada (requer compensação de atraso a ser definido no máximo). Se nenhum encaixe automático está disponível, Comece definindo os parâmetros de célula inteira disca para pF 15 e 15 mΩ (valores típicos para estas células) e ajuste para produzir as saídas como mostrado na Figura 5(ii). Aumentar o dial de compensação série resistência ~ 75% e reajustar os mostradores de células inteiras parâmetros conforme a Figura 5(iii). Antes de iniciar a experimentação Observe a medição de capacitância de célula a primeira adaptação automatizada ou de marcação após compensação manual.Nota: Esse valor é usado para normalizar as correntes ao tamanho da célula. Compensação por resistência série pode precisar ser ajustada durante a experimentação como acesso pode continuar a melhorar devido à incorporação de anfotericina B para o patch. Aplica drogas aos navios, conforme descrito na etapa 2.17. Aplica os protocolos de tensão (degraus ou rampas) como por exigências experimentais.Nota: Tensão típica passo os protocolos, 0,1 – 1 s de duração, são aplicadas na exploração potencial em 10-20 mV incrementa a cada 5-10 s para produzir uma família de correntes de tensão está ativado. Como alternativa, usar protocolos de rampa para medir correntes em uma série de tensões em uma ‘varredura’ por aumentar a tensão lentamente (100-200 mV/s) de , por exemplo, -80 a + 80 mV (aplicado a cada 5-10 s) com amostragem off-line da corrente em 10 intervalos de mV durante a rampa. É possível combinar imagens de Ca2 + com remendo-braçadeira gravação como segue. Isole as arteríolas conforme seção 1. Carregar com Ca2 + indicador corantes como por etapas 3.1-3.2. Montagem da câmara de gravação de acordo com o ponto 4. Tome cuidado para limitar a exposição à luz durante estes procedimentos.Nota: Até à data, não foi possível combinar remendo-braçadeira com estudos miografia de pressão devido à perda da membrana basal e integridade da embarcação durante o processo de dissociação enzimática