Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Alle experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd overeenkomstig richtsnoeren binnen de UK dieren (wetenschappelijke Procedures) Act van 1986 en goedgekeurd door de Queen’s University van Belfast dierenwelzijn en ethische beroepsinstantie. 1. isolatie van retinale arteriolen Opmerking: Het volgende protocol wordt gebruikt om te isoleren van de retinale arteriolen. Deze methode is geoptimaliseerd voor rat retinale arteriolen maar kan worden gebruikt met muis netvlies. De opbrengst van vaartuigen, echter, is lager bij gebruik van muizen. Make-up een oplossing voor lage Ca2 + met Hanks’ (LCH) zoals aangegeven in tabel 1.Opmerking: Deze oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 3 dagen bij 4 ° C (wanneer met behulp van LCH opgeslagen, ervoor zorgen dat het equilibrates tot kamertemperatuur en de pH correct voordat er gebruik is). Monteren van de volgende apparatuur voor het verzamelen van weefsel om ervoor te zorgen snelle microdissection van het netvlies: gekarteld pincet gebogen schaar, dissectie schotel (siliconen beklede petrischaal), één scherpe mes, 2 sets van pincet (bot) 1 glazen pipet van Pasteur (brand gepolijst naar een strak maar niet smalle tip), 1 wegwerp plastic pipet (met tip om het diafragma te afgesneden ~ 5-7 mm), 1 glas ronde onderkant reageerbuis (5 mL) en houder. Ongeveer 50 mL LCH in een bekerglas van glas decanteren en bereiden een tweede bekerglas te decanteren afval vloeistoffen.Opmerking: Zie Tabel van materialen voor specificaties en details van de fabrikant. Euthanaseren van de rat CO2 gevolgd door cardiale punctie met exsanguinate (Vermijd cervicale dislocatie of hersenschudding als dit schade aan bloedvaten in het oog veroorzaken kunnen). Intrekken van de oogleden met een getande Tang, en gebruik vervolgens de gebogen schaar om rond de orbitale spieren en door middel van de oogzenuw te snijden. Voorzichtig uitpakken de ogen van de baan verzorgen om dwars door eventuele resterende bijlagen met een schaar. Plaats de ogen ondergedompeld in LCH oplossing op de schotel van de dissectie (ogen kunnen worden vervoerd op ijs in een oplossing van LCH indien nodig). Een set van botte pincet gebruiken om het oog naar de schotel te verankeren door de orbitale spier bijlagen of de oogzenuw; Zorg ervoor dat de verankerende punt zo dicht mogelijk bij de sclera te stabiliseren van het oog. Met behulp van het blad, het hoornvlies langs de ora serrata doorsnijden en de lens verwijderen door zachtjes te drukken op de sclera met een tang. Snijd de oog-cup doormidden symmetrisch via de optische schijf. Met behulp van gesloten pincet voorzichtig ‘borstel’ uit het netvlies van de twee helften van de oogschelp verzorgen om eventuele resterende bijlagen op de optische schijf te verwijderen. Herhaal het proces met het tweede oog en breng het ontleed netvlies in de reageerbuis met behulp van de plastic pipet en een kleine daling van LCH medium. Met behulp van de plastic pipet vullen de proefbuis met LCH te ~ 5 mL en toestaan van het netvlies te vestigen aan de onderkant. Wassen het weefsel ongeveer 3 keer doordat ~ 4 mL van de oplossing van de buis en het toevoegen van verse LCH met behulp van de plastic pipet. Waar nodig, verwijder vreemde weefsel zoals opschortende ligamenten, glasvocht humor en haren. Wassen van de binnenkant van het glas Pasteur Pipet (gepolijst tip) met LCH om te voorkomen dat het weefsel kleven aan de pipet. Verwijderen met behulp van de dezelfde precisiepipet, ongeveer 4 mL oplossing uit de reageerbuis. Dan Voeg ongeveer 2 mL verse LCH. Zachtjes distantiëren (triturate) het netvlies door het tekenen van het weefsel via het puntje van het glas Pipetteer langzaam en verdrijven de inhoud in de reageerbuis. Opmerking, probeer niet te introduceren bubbels in dit stadium. Herhaal stap 1.10 totdat het netvlies worden verdeeld tot een grootte van ongeveer 2-3 mm2. Spoel de binnenkant van de pipet met ongeveer 2 mL van LCH en verdrijven dit in de reageerbuis. Laat de inhoud om af te wikkelen naar de bodem van meer dan 5-10 min. Herhaal de verpulvering proces zoals beschreven in 1.10-1.12 met een beetje meer kracht totdat de stukjes weefsel ongeveer 1 mm2 in grootte zijn. Nogmaals, laat het weefsel te vestigen voor 5-10 min. Herhaal de stappen 1.10-1.12 voor de derde keer met meer kracht totdat de inhoud zijn volledig gehomogeniseerd en geen stukken van netvlies blijven (de oplossing melkachtig uiterlijk moet worden).Opmerking: Deze techniek levert maximaal 8 arteriolare segmenten (relatief vrij van de omringende neuropile en met sommige takken resterende intact) per isolatie 8-45 µm in diameter en 200-2500 µm in lengte te meten. Breng een kleine hoeveelheid van het isolaat in een fysiologische opname kamer of toevoegen van fluorescente kleurstoffen voor meting van intracellulaire Ca2 + concentratie ([Ca2 +]i; zie punt 3). Verwijdering van restanten van eye cups en oplossing ze tijdens de isolatie volgens de lokale wetgeving omtrent de behandeling van dierlijk afval verwijderd.Opmerking: Hoewel het is aan te raden om te experimenteren op schepen onmiddellijk na isolatie, overtollige isolaat kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 8 uur. 2. arteriolar druk Myography Opmerking: Arteriolar druk myography wordt uitgevoerd als volgt met behulp van apparatuur beschreven in figuur 1A, B en de Tabel van materialen. Pipetteer een aliquoot deel van het netvlies vaartuig homogenaat (1-2 mL; geïsoleerd overeenkomstig punt 1) naar een fysiologische opname kamer (gedeeltelijk gevuld met nominaal Ca2 +gratis Hanks oplossing; 0Ca2 + Hanks’; Zie tabel 1) gemonteerd op het podium van een omgekeerde Microscoop. Laat de schepen te vestigen op de bodem van de kamer van de opname voor ten minste 5 minuten voordat experimenten. Visueel scannen in de zaal van de opname te identificeren arteriolen > 200 µm in lengte en het bezitten van een open einde, waardoor het schip kan worden gecanuleerd (identificatie van het type vaartuig wordt verder onderzocht in het gedeelte ‘ resultaten ‘). Positie van het schip in het midden van het gezichtsveld. Als geen geschikte vaartuigen aanwezig zijn, Pipetteer een aliquoot gedeelte van het schip homogenaat in de zaal van de opname per stap 2.1. Verankeren van de ene kant van het schip met fijne pincet en een kleine wolfraam draad slip (75 µm diameter en ~ 2-4 mm in lengte) over het schip geplaatst (Zie Figuur 1 c(i)). Om dit te doen de draad in de Tang houden en zoek de Tang boven de kamer opnemen. Identificeren van de overeenkomstige schaduw van de verlostang onder de Microscoop, lager van de verlostang in het bad, totdat de draad blijkt. Plaats de draad over het schip ongeveer 200 µm van het open einde en neerzetten van de draad loodrecht op de lengteas van het vaartuig.Opmerking: Het gewicht van de wolfraam draad is voldoende om de occlude van het schip distally afgebroken stroom van luminal inhoud tijdens het cannulation en overdruksystemen. De arteriole verplaatsen in een geschikte positie in de vergaderzaal van de opname zodat het horizontaal in het bad met het open uiteinde in overeenstemming met de canule overdruksystemen ligt (Zie Figuur 1 c(ii-iv)). Dit doen door zachtjes duwen de occluding wolfraam draad slip met een extra sectie van draad gehouden binnen de verlostang; Raak niet de arteriole zoals het onherroepelijk aan de verlostang houden zal. Indien nodig (voor lange arteriole segmenten), toevoegen extra wolfraam draad glijdt over het schip zodanig zijn dat de afstand tussen de afsluiting en open uiteinden van het vaartuig niet meer dan 200 µm; Dit helpt om te voorkomen dat de verhuizing van het gezichtsveld bij overdruksystemen arteriole. Als het vaartuig een zij-takken heeft, moeten dit ook worden geroteerd met extra wolfraam draad stukjes. Gooi het schip als een zijaansluiting kan niet worden geroteerd. Perfuse de kamer met 0Ca2 + Hanks bij 37 ° C te verwijderen vreemde retinale weefsel en te warm het bad aan fysiologische temperaturen.Opmerking: Een standaard zwaartekracht-gevoed Bad perfusie en in-line kachel systeem kan worden gebruikt voor dit doel (Zie figuur 1A). 0Ca2 + Hanks wordt gebruikt om de procedure cannulation, sinds verwijdering van externe Ca2 + zorgt ervoor dat de arteriolen verwijde blijven. Fabriceren overdruksystemen cannulas van borosilicaatglas filamented haarvaten (tip diameter ~ 3-10 µm afhankelijk van de diameter van het schip worden gecanuleerd; kleinere schepen vereisen smaller cannulas; Zie de Tabel van materialen) met behulp van een de trekker van de micro-elektrode en rug-vulling met 0Ca2 + Hanks oplossing. Zorg ervoor dat de schacht van de canule is zachtjes taps toelopende naar de tip om het cannulation te vergemakkelijken. Mount de canule in een pipet houder gekoppeld aan een 10 mL spuit via een Y-connector en een 3-weg kraan; Dit wordt gebruikt om druk uitoefenen op het systeem, druk wordt opgenomen met behulp van een manometer aangesloten aan de andere kant-tak van de Y-connector (Zie figuur 1B).Opmerking: Een pipet ‘helper’ is vereist om te helpen met het cannulation-proces. Fabriceren van de Pipet van een capillaire borosilicaatglas trok op een trekker met micro-elektrode met een diameter van de tip van 0,5 – 2 µm. zwaar vuur Pools de Pipet (vaak tot gesloten) met behulp van een microforge. Plaats de pipet helper loodrecht op de lange-as van het schip dicht bij het open uiteinde met behulp van een mechanische manipulator 3-as (Zie Figuur 1 d). Plaats de pipet helper net boven het schip, maar raken het niet. Plaats de Pipet van de cannulation aan het open einde van het schip (Zie Figuur 1 d en 2A(i)) met behulp van een fijne micromanipulator; plaats het uiteinde onmiddellijk grenzend aan de opening, zoals beoordeeld door het vlak van de focus op de Microscoop (bij 20 X) aan te passen. Wanneer zowel het einde van het vaartuig en het uiteinde van de canule zijn in focus op hetzelfde moment juist gepositioneerd is de canule voor cannulation (Zie figuur 2A(ii)). De canule overdruksystemen vooraf in het schip-diafragma met behulp van de besturingselementen van de x-as van de mooie micromanipulator (Zie figuur 2A(iii)). Het beoordelen van het succes van cannulation door de canule langs de y-as te verplaatsen. Als de canule binnen het schip blijft is met succes gecanuleerde (Zie figuur 2A(iv)). Als de canule buiten het schip beweegt, de canule dreigt te worden boven het vaartuig; zo ja Herhaal stap 2.10-2.11 met de canule op een lagere vliegtuig in de z-as. Na de succesvolle cannulation zachtjes lager de helper pipet naar het schip te bedwingen de arteriole. De arteriolar muur gids over de canule overdruksystemen met de helper Pipet, op hetzelfde moment als de cannulation-Pipet is gevorderd verder in vaartuig lumen tot een afstand van ongeveer 30-50 µm (Zie figuur 2A(v, vi)).Opmerking: Deze procedure vereist gelijktijdige, gecontroleerde beweging van beide manipulatoren (helper Pipetteer richting de canule terwijl de canule het vaartuig lumen pakt) en zal vereisen uitgebreide praktijk te bereiken van een hoog slagingspercentage. Wijzigen van de bad-oplossing aan normale Hanks met 2 mM Ca2 + (Zie tabel 1) bij 37 ° C. Meestal is het hierdoor een lichte vernauwing van de arteriole en de vorming van een goede afdichting rond de canule overdruksystemen. De helper pipet kan vervolgens worden afgestapt van het vaartuig. Toestaan dat een goede afdichting te ontwikkelen voor 15 min. weergave het vaartuig met behulp van een USB-camera (en afbeelding acquisitie software) gekoppeld aan de Microscoop en aanpassen van de focus om te maximaliseren van het contrast tussen de grenzen van het vaartuig en de ruimten van het externe en intraluminale (Zie Figuur 2B). Afbeelding van het vaartuig op 0,5 – 5 frames/sec. Na 1 min van de opname op 0 mmHg, de intraluminale druk op het gewenste niveau te verhogen door het sluiten van de 3-weg kraan op de canule drukregeling aangesloten (Zie figuur 1B) en breng een kleine hoeveelheid van positieve druk aan het systeem via de spuit. Observeer de druk op de manometer wijzigen.Opmerking: Druk kan worden toegevoegd in een stap wijs mode maximaal 100 mmHg of aan een andere waarde bijvoorbeeld 40 mmHg (aanpassing retinale arteriolar druk in vivo)23. Het vaartuig moet snel verwijden bevestiging van de succesvolle cannulation. Let op, druk-geïnduceerde vasoconstrictie (dat wil zeggen, de myogenic reactie) zal vervolgens ontwikkelen over een periode van 15 min, maar vanwege de geringe omvang van deze vaartuigen, dit kan niet altijd zijn visueel detecteerbaar. Zorgvuldig toezicht houden op het schip tijdens eerste overdruksystemen voor de hand liggende lekken. Bronnen van lek afkomstig kunnen zijn van gekloofd zij takken of onvoldoende afdichting van de canule aan de binnenkant van de arteriole. Kijk voor de inhoud van de intraluminale verlaten van het schip. Kleinere, minder voor de hand liggende lekken kunnen blijken na verloop van tijd als een daling van de druk op de manometer. Indien mogelijk, de opening occlude met extra wolfraam draad stukjes verzorgen niet te storen van de canule. Preparaten met voor de hand liggende lekkage uitsluiten van verdere analyse. Toepassing van de drug van belang abluminally op het schip voorafgaand aan, of volgende, 15 min overdruksystemen afhankelijk van de doelstellingen van het experiment (de voormalige kunt effecten op de ontwikkeling van de myogenic Toon te bepalen, terwijl de laatstgenoemde maakt een analyse van de effecten op stationaire myogenic Toon). Een typische drug delivery systeem is afgebeeld in figuur 3A. Plaats van de levering outlet loodrecht op het gedeelte van het schip van belang (zoals wordt geïllustreerd in Figuur 1 d) op een afstand ~ 500 µm uit de buurt van het schip van belang verzorgen om ervoor te zorgen dat de uitlaat optimaal is schuin naar volledig superfuse het gebied (Zie Figuur 3B). Ervoor zorgen dat wijzigingen in perfusie fysiek niet het vaartuig storen. Na voltooiing van een experiment, toepassing van een oplossing voor 0Ca2 + Hanks met 10 µM wortmannin (myosin lichtketting kinase inhibitor) om het schip om te bepalen van de passieve diameter maximaal te verwijden.Opmerking: De kracht van het zegel van de cannulation kan getest worden aan het einde van het experiment door verhoging van de intraluminale druk > 100 mmHg. De meerderheid van de schepen zal blijven zelfs bij deze hoge druk geven een goede afdichting. Uitvoeren van off line analyse met behulp van de randdetectie om wijzigingen in de arteriolar diameter te houden (Zie Tabel van materialen voor voorgestelde software). Normaliseren de arteriole diameter aan de passieve diameter voor vergelijking tussen schepen. 3. Ca2 + Imaging Opmerking: Geïsoleerde retinale arteriolen zijn voorbereid op conventionele (microfluorimetry) en confocal Ca2 + imaging als volgt (met behulp van apparatuur gedetailleerd in Tabel van materialen). Bereiden retinale homogenates in een tube van 5 mL glas test zoals beschreven in sectie 1. 1 mL van de retinale homogenaat toevoegen Fura – 2 AM (microfluormetric Ca2 + opname) of Fluo – 4 AM (confocal Ca2 + imaging) om een eindconcentratie van 5 µM (beschermen tegen licht); kleurstof indicatoren Laad bij voorkeur in de zachte spiercellen. Bewaren bij kamertemperatuur in het donker voor 2 h flicking van de kant van de buis om 15-20 min om resuspendeer de retinale weefsel. Daarna Verdun de homogenaat 1:4 met LCH oplossing om verder te verminderen kleurstof laden.Opmerking: Schepen blijven levensvatbaar is voor maximaal 6 uur (wanneer opgeslagen bij 4 ° C en in het donker); maar het wordt aangeraden dat experimenten zo snel mogelijk aan het verminderen van de impact van compartimentering van de kleurstof in interne organellen of extrusie van de kleurstof na verloop van tijd zijn begonnen. 1-2 mL retinale homogenaat overbrengen in een glassbottom opname kamer (gedeeltelijk gevuld met LCH) gemonteerd op het podium van een omgekeerde Microscoop verbonden met een Ca2 + microfluorimetry of confocale microscopie systeem. Anker arteriolen loodrecht op de richting van de stroom over de opname zaal, met wolfraam draad stukjes (50 µm diameter, lengte van 2-4 mm) verdeelde ~ 100-200 µm uit elkaar langs de scheepslengte (Zie Figuur 3 c) met behulp van een soortgelijke techniek die beschreven in stap 2.3. Perfuse van het bad met normale Ca2 + Hanks oplossing bij 37 ° C. Plaats de drug delivery outlet zoals afgebeeld in Figuur 3 c en drugs van toepassing op vaartuigen zoals beschreven in stap 2.17. Voor conventionele Ca2 + imaging, verlichten het vaartuig met 340/380 nm licht via de doelstelling van de onderdompeling UV van een olie (bijvoorbeeld 100 X, NA 1.3) en verzamelen van uitgestoten fluorescentie bij 510 nm via een foton tellen fotomultiplicator (PMT). Aan het einde van elk experiment, achtergrond fluorescentie te meten door het blussen van het vaartuig met een MnCl-bevattende oplossing (Zie tabel 1). Achtergrond-gecorrigeerde fluorescentie ratio’s (R-F340/F380) gebruiken voor analyse of converteren naar het intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]i) met behulp van Rmin enmax metingen van R (zie tabel 1; toegepaste voorafgaand aan het blussen van 24) en de Grynkiewicz vergelijking25. Voor confocal Ca2 + imaging, prikkelen Fluo-4 geladen vaartuigen op 488 nm en vangen de emissies van de resulterende fluorescentie bij 490-535 nm in beide lijn scan modus (xt) of xyt scan modi (512 x 512 pixels; voorgestelde pinhole 300 nm). Normaliseren van metingen aan de fluorescentie opgenomen op het tijdstip t = 0s (F/F0). Het beoordelen van wijzigingen in [Ca2 +]i tijdens drug toepassingen of drukregeling off line in specifieke regio’s van belang (ROIs) met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Indien nodig, Ca2 + beeldbewerking met druk myography uitvoerenOpmerking: De bovenstaande beschrijvingen zijn geoptimaliseerd voor V510 schepen; het is echter mogelijk om te combineren met Ca2 + imaging met druk myography als volgt. Isoleren arteriolen overeenkomstig punt 1. Laden met Ca2 + indicator kleurstoffen per stap 3.1-3.2. Breng de arteriolen in de zaal van de opname en cannulate overeenkomstig punt 2. Zorg voor het beperken van blootstelling aan het licht tijdens de montage-procedure. Meten Ca2 + per stap 3.5 of 3.7 hierboven. Druk uitoefenen op het vaartuig en herhaal de meting van Ca2 +. Gelijktijdige meting van de diameter van het vaartuig is afhankelijk van de wijze van Ca2 + meting en gebruikte apparatuur.Opmerking: Voor confocal Ca2 + meting het kan noodzakelijk zijn te pre- en post drukregeling van afbeelding aparte regio’s als gevolg van verbleking van de kleurstof tijdens lange belichtingen aan het licht. 4. Patch-Clamp electrofysiologie Opmerking: Geheel-cel en één-kanaals opname is mogelijk van individuele arteriolar zachte spiercellen nog ingebed in hun bovenliggende arteriolen als volgt (met behulp van apparatuur gedetailleerd in Tabel van materialen). Isoleren en verankeren van retinale arteriolen in de zaal van de opname, zoals beschreven in stap 1, 2.3 en 3.3. Voor patch-clamp opnemen, de draad van de wolfraam slips zijn verdeeld 200-800 µm apart langs het schip. Verwijderen van basale lamina rondom de arteriole en elektrisch afkoppelen aangrenzende zachte spiercellen en onderliggende endotheliale cellen voorafgaand aan patch klemmen. Hiervoor superfuse het schip met een opeenvolgende reeks van enzym oplossingen (tabel 1) bij 37 ° C gedurende de vereiste duur.Opmerking: De duur van de blootstelling van het enzym is geoptimaliseerd voor de retinale arteriolen rat (protease, ~ 8 min; collagenase, ~ 12 min) en afhankelijk van het debiet van de drug delivery systeem (~ 1 mL/min op onze set-up) en de activiteiten van de eenheid van de partij van enzymen wordt gebruikt. Beoordelen van het niveau van de spijsvertering op visuele scheiding van endotheel en lagen van de gladde spieren tijdens de collagenase stap zoals afgebeeld in Figuur 4. Zodra de scheiding van de lagen van de cel wordt waargenomen (zoals weergegeven in figuur 4B), toepassing DNAse ik oplossing (~ 4 min) vervolgens het beëindigen van de spijsvertering door vervanging van de bad-oplossing met normale Ca2 + Hanks oplossing. Verwijder alle resterende onderdelen van basale lamina en/of perifere neuropile door voorzichtig vegen de gesloten toppen van fijne pincet langs het oppervlak van het schip. Trek en Pools glas haarvaten (Tabel of Materials), vul met pipet oplossing (tabel 1) en plaats stevig in de houder van de Pipet van de patch-clamp-headstage. Plaats de pipet op een hoek van 45° ten opzichte van de kamer van de opname en het opmars naar het schip met de Grove instelling op een gemotoriseerde micromanipulator. Selecteer een cel van de gladde spieren van de vaatwand uitsteekt en waarvan oppervlak is vrij van zichtbare puin (Zie figuur 4B). Plaats het uiteinde van de pipet patch verticaal op de cel van belang en lagere geleidelijk aan het gebruik van de boete/langzame beweging van de micromanipulator om contact met het membraan van de gladde spieren. Beoordelen van het contact tussen cel en Pipetteer visueel uit cel verkeer en een verandering in de pipet weerstand gemeten met gebruikmaking van de membraan (zegel) test-protocol in de acquisitie software (5-10 mV negatieve stap van 0 mV, frequentie 25 KHz; Zie figuur 5A(i)) . Wanneer het zegel verzet 5-voudig is toegenomen (bijvoorbeeld gestegen van 2 tot 10 MΩ; Figuur 5A (ii)) negatieve druk uitoefenen Transient op de achterkant van de houder van de pipet via een y-stuk, 3-weg kraan, spuit en buizen aangesloten op de pipet houder (gemonteerd op een gelijkaardige manier aan die gebruikt in drukregeling van de arteriolen, Zie figuur 1B). Herhalen van toepassingen van negatieve druk tot een gigaseal (> 1 GΩ weerstand; zoals aangegeven door de test van de membraan in de acquisitie software) is gevormd (figuur 5A(iii)). Dit proces kan duren 1-5 min. Indien een gigaseal geen vorm, kies een andere cel aan patch klem met behulp van een precisiepipet verse patch. Een bedrijf potentiële toepassen op de cel via de acquisitie software volgens het experiment wordt uitgevoerd (meestal 0-40 en -80 mV). Studie (op-cel) enkellijns activiteit in de huidige configuratie. Als alternatief, genereren binnenstebuiten patches door snel de patch Pipet uit het celoppervlak intrekken na de vorming van de gigaseal. De vrije uiteinden van het membraan kunnen opnieuw anneal onder deze omstandigheden Verwijder de pipet uit het bad via snelle verticale beweging van de manipulator (grof instelling). Snel terug via de meniscus te verwijderen van het hervormde membraan waardoor alleen de patch in het uiteinde van de pipet. De samplingfrequentie ingesteld op de software van de verwerving tot 5 KHz en activeren van de continu opnamemodus naar record kanaal activiteit. Geen spanningen wijzigingen toepassen indien nodig via de software of de versterker. Indien nodig, toepassen drugs schip/membraan patch zoals beschreven in stap 2.17. Als membraan stretch vereist is, negatieve druk uitoefenen op de achterkant van de pipet met behulp van de spuit op een manometer via een 3-weg kraan en y-connector aangesloten. Enkellijns opnames voor open kans en unitaire huidgeleiding volgens standaardprocedures26analyseren. Voor hele cel huidige opname kabeltrek- en Pools pipetten volgens de Tabel van materialen, vullen met pipet oplossing met amfotericine B (3 mg amfotericine B toevoegen aan 50 µL van DMSO 3-6 µL van dit toevoegen aan 1 mL pipet geheel-cel oplossing; Bewerk ultrasone trillingen ten te mengen) en vormen een zegel per stappen 4.6-4.9. Als gevolg van de opneming van amfotericine B behoeft er niet scheuren van het membraan binnen het uiteinde van de pipet om hele cel toegang te krijgen. Toegang, die zal worden opgedaan geleidelijk, met behulp van het testprotocol membraan in de acquisitie software monitoren (-20 mV stap van -40 mV, samplefrequentie 25 KHz; Zie figuur 5B). Geautomatiseerde montage van capacitieve transiënten in sommige software levert real-time metingen van toegang weerstand en capaciteit van de cel (u kunt ook de relatieve daling van de transiënten kan worden beoordeeld door oog). Zodra de toegang weerstand tot < 15 MΩ daalt, voeren serie weerstand compensaties (figuur 5C) met behulp van de gehele-cel met de parameter wijzerplaten (precisiecapaciteit en serie weerstand) op de versterker. Om dit te doen, gebruik de geautomatiseerde montage-waarden om in eerste instantie de wijzerplaten (Zie figuur 5C(ii)) en vervolgens verhogen van de wijzerplaat van de compensatie van serie-weerstand, (zowel voorspelling en correctie indien beschikbaar op de versterker) opnieuw aan te passen de hele cel compensaties terwijl het verminderen van de capacitieve van voorbijgaande aard (Zie figuur 5C(iii)). Zorg niet te over compenseren (zoals weergegeven in figuur 5C(iv)). Meestal is het mogelijk om te compenseren van de serie weerstand door 75% in geperforeerde patch modus (hiervoor moet van vertraging compensatie moet worden ingesteld op maximaal). Als geen geautomatiseerde montage beschikbaar is, beginnen met de instelling van de parameters van het geheel-cel belt 15 pF en 15 mΩ (typische waarden voor deze cellen) en vervolgens aanpassen voor de productie van de resultaten zoals weergegeven in figuur 5C(ii). De serie weerstand compensatie wijzerplaat tot ~ 75% te verhogen en passen de wijzerplaten van de gehele-cel parameters volgens figuur 5C(iii). Opmerking de cel precisiecapaciteit meting vanaf de eerste geautomatiseerde montage of vanaf de wijzerplaat na handmatige compensatie vóór experimenten.Opmerking: Deze waarde wordt gebruikt om stromingen te celgrootte normaliseren. Compensatie voor serie weerstand moet mogelijk worden aangepast tijdens experimenten zoals toegang kan blijven verbeteren als gevolg van de verdere integratie van amfotericine B in de patch. Drugs van toepassing op vaartuigen zoals beschreven in stap 2.17. Spanning protocollen (stappen of hellingen) gelden per experimentele eisen.Opmerking: Typische spanning stap protocollen, 0,1 – 1 s in duur, worden toegepast van het bedrijf potentieel in 10-20 mV verhoogt elke 5-10-s voor de productie van een familie van spanning-geactiveerde stromingen. Als alternatief oprit protocollen te gebruiken voor het meten van stromingen, een aantal spanningen in een ‘sweep’ door het voltage langzaam speedramp (100-200 mV/s) van bijvoorbeeld -80 tot + 80 mV (toegepast elke 5-10-s) met offline bemonstering van de huidige 10 mV tussenpozen tijdens de oprit. Het is mogelijk om het combineren van Ca2 + imaging met patch-clamp opnemen als volgt. Isoleren arteriolen overeenkomstig punt 1. Laden met Ca2 + indicator kleurstoffen volgens stappen 3.1-3.2. Monteren in de zaal van de opname overeenkomstig punt 4. Zorg voor het beperken van blootstelling aan het licht tijdens deze procedures.Opmerking: Tot op heden niet gelukt te combineren patch-clamp met myography studies van de druk als gevolg van het verlies van de membraan van de kelder en de integriteit van het schip tijdens het enzymatische dissociatie