Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

Todos los experimentos aquí descritos fueron realizados según las directrices contenidas en la ley de Reino Unido los animales (procedimientos científicos) de 1986 y fueron aprobados por de la reina Bienestar Animal de la Universidad de Belfast y órgano de examen de ética. 1. aislamiento de arteriolas retinianas Nota: El siguiente protocolo se utiliza para aislar las arteriolas retinianas. Este método está optimizado de arteriolas de retina de rata pero se puede utilizar con retinas de ratón. El rendimiento de los buques, sin embargo, es inferior al usar ratones. Hacer una solución de baja Ca2 + que contienen madejas (LCH) como se muestra en la tabla 1.Nota: Esta solución puede conservarse hasta 3 días a 4 ° C (cuando uso almacena LCH, asegúrese de que equilibra a la temperatura y el pH es correcto antes de usar). El siguiente montaje antes de la obtención de tejido para asegurar la rápida microdisección de las retinas: dentado fórceps, tijeras curvas, hoja de plato (plato de Petri recubiertas de silicona), solo bordeada de disección, 2 sets de 1 cristal (Romo) fórceps pipeta Pasteur (fuego pulido a una punta suave pero no estrecha), 1 pipeta de plástico desechable (con punta cortado para aumentar la abertura a ~ 5-7 mm), 1 vaso redondo tubo de prueba inferior (5 mL) y soporte. Aproximadamente 50 mL de HCl en un vaso de vidrio se decanta y preparar un segundo vaso de precipitados decantar residuos líquidos.Nota: Ver Tabla de materiales para las especificaciones y detalles del fabricante. Eutanasia la rata usando CO2 seguido por punción cardiaca para exsanguinate (evitar la dislocación cervical o conmoción ya que pueden dañar los vasos sanguíneos en el ojo). Retraer los párpados con pinzas dentadas, luego utilice las tijeras curvas para cortar alrededor de los músculos orbitales y a través del nervio óptico. Extraiga suavemente los ojos de la órbita, teniendo cuidado de cortar a través cualquier accesorio restantes con las tijeras. Coloque los ojos sumergidos en solución de HCl en la bandeja de disección (ojos pueden transportarse en hielo en una solución de HCl si es necesario). Utilizar un sistema de pinzas embotadas para anclar el ojo en el plato por los accesorios del músculo orbital o del nervio óptico; Asegúrese de que el punto de anclaje esté lo más cercano posible de la esclera para estabilizar el ojo. Usando la cuchilla, corte a través de la córnea a lo largo de la ora serrata y retirar la lente presionando suavemente sobre la esclera con el fórceps. Corte de la taza del ojo en la mitad simétricamente a través del disco óptico. Utilizando cierra pinzas suavemente ‘cepillo’ por las retinas de las dos mitades del cilindro teniendo cuidado de retirar cualquier accesorio restante en el disco óptico. Repita el proceso con el segundo ojo y transferir las retinas disecadas en el tubo de ensayo usando que la pipeta de plástico y una pequeña gota de medio de HCl. Con la pipeta de plástico llene el tubo de ensayo con HCl a ~ 5 mL y permitir que las retinas para instalarse en la parte inferior. Lavar el tejido aproximadamente 3 veces sacando ~ 4 mL de solución del tubo y añadir HCl fresco utilizando la pipeta de plástico. En caso necesario, remover el tejido extraño como ligamentos suspensorios, humor vítreo y pelos. Lave el interior del pipeta de Pasteur (punta de pulido) con HCl para evitar que el tejido se pegue a la pipeta de vidrio. Usando la misma pipeta, retire aproximadamente 4 mL de solución de la probeta. Luego añada aproximadamente 2 mL de HCl fresco. Suavemente disociar (triture) las retinas dibujando el tejido a través de la punta de vidrio pipeta lentamente y expulsar el contenido en la probeta. Nota, trate de no introducir burbujas en esta etapa. Repita paso 1.10 hasta las retinas están quebradas para arriba a un tamaño de aproximadamente 2-3 mm2. Lavar el interior de la pipeta con aproximadamente 2 mL de HCl y vierta esto en la probeta. Permita que el contenido a instalarse en la parte inferior sobre 5-10 minutos. Repita el proceso de trituración como se indica en 1.10 1.12 con fuerza un poco más hasta que las piezas de tejido aproximadamente de 1 mm2 de tamaño. Otra vez, permitir que el tejido a reposar 5-10 minutos. Repita los pasos 1.10 1.12 por tercera vez con más fuerza hasta que los contenidos son totalmente homogeneizados y no pedazos de retina permanecen (la solución debe ser lechosa en apariencia).Nota: Esta técnica producirá hasta 8 segmentos arteriolare (relativamente libres de alrededor de neuropilos y con algunas ramas quedan intactos) por aislamiento medición 8-45 μm de diámetro y 200-2500 μm de longitud. Transferir una pequeña cantidad de la cepa en una cámara de grabación fisiológica o añadir tintes fluorescentes para la medición de Ca2 + concentración intracelular ([Ca2 +]i; ver sección 3). Eliminar restos de tapas oculares y solución durante el proceso de aislamiento según las normas locales sobre el manejo de los desechos animales.Nota: Mientras que es recomendable experimentar en los buques inmediatamente después de la aislamiento, aislante excedentes puede almacenarse a 4 ° C durante 8 h. 2. arteriolar presión miografía Nota: La presión Arteriolar miografía se lleva a cabo como sigue usando equipos detallados en la figura 1A, B y la Tabla de materiales. Transferir una alícuota de homogeneizado de vasos retinianos (1-2 mL; aislado según la sección 1) a una cámara de grabación fisiológica (parcialmente lleno con nominalmente solución de Hanks Ca2 +libre; 0Ca2 + Hanks’; ver tabla 1) montado en el escenario de un microscopio invertido. Deje los vasos se colocan en la parte inferior de la cámara de grabación de al menos 5 minutos antes de la experimentación. Analizar visualmente a través de la cámara de grabación para identificar arteriolas > 200 μm de longitud y posee un extremo abierto a través del cual el buque puede ser canulado (identificación del tipo de embarcación es explorado en la sección de resultados). Coloque el vaso en el centro del campo de visión. Si no hay recipientes adecuados están presentes, transferir otra alícuota de homogeneizado de buque en la cámara de grabación según el paso 2.1. Ancla un extremo de la embarcación utilizando pinza fina y un resbalón de alambre de tungsteno pequeño (75 μm de diámetro y ~ 2-4 mm de longitud) sobre el buque (véase la figura 1(i)). Para ello sostener el cable en la pinza y coloque las pinzas por encima de la cámara de grabación. Identificar la sombra correspondiente de las pinzas debajo del microscopio, baje el fórceps en el baño hasta que el alambre se hace evidente. Coloque el alambre sobre el recipiente aproximadamente 200 μm del extremo abierto y el alambre perpendicular al eje longitudinal de la nave de la gota.Nota: El peso del alambre de tungsteno es suficiente para ocluir el vaso distal parando el flujo del contenido luminal durante la canulación y presurización. Mover la arteriola en una posición adecuada dentro de la cámara de grabación que se encuentra horizontalmente a través de la bañera con el extremo abierto en consonancia con la cánula de presurización (ver figura 1(ii-iv)). Para ello, empujar suavemente la oclusión hoja de alambre de tungsteno con una sección adicional del alambre en la pinza; No toque la arteriola como irreversible se adherirá a las pinzas. En caso necesario (para segmentos de larga arteriola), agregar adicional tungsteno alambre se desliza sobre el buque tales que la distancia entre los extremos ocluidos y abiertas del vaso no más de 200 μm; Esto ayuda a prevenir la arteriola mover fuera del campo de visión sobre presurización. Si el barco tiene cualquier ramas laterales, también éstos deben ocluidos con engobes de alambre de tungsteno adicional. Si un rama lateral no puede ser ocluido deseche el recipiente. Inundar la cámara de 0Ca2 + Hanks a 37 ° C para remover el tejido retiniano extraño y para calentar el baño a temperatura fisiológica.Nota: Un sistema de calentador de perfusión y en la línea de baño gravedad estándar se puede utilizar para este propósito (ver figura 1A). 0Ca2 + Hanks’ se utiliza para facilitar el proceso de canalización, desde retiro de externo Ca2 + se asegura de que las arteriolas permanecen dilatadas. Fabricación de cánulas de presurización desde el vidrio de borosilicato los capilares (punta diámetro ~ 3-10 μm, dependiendo del diámetro del recipiente a ser canulado; embarcaciones más pequeñas requieren más cánulas; vea la Tabla de materiales) con un tirador del microelectrodo y parte posterior llenado con solución de 0Ca2 + Hanks. Asegúrese de que la caña de la cánula se afila suavemente hacia la punta para facilitar la canulación. Montaje de la cánula en un porta pipeta conectada a una jeringa de 10 mL a través de un conector y un grifo de 3 vías; se utiliza para presurizar el sistema, la presión se registran utilizando un manómetro en el lado-brazo del conector en Y (ver figura 1B).Nota: Una pipeta de ‘ayudante’ es necesaria para ayudar en el proceso de canalización. Fabricar la pipeta de un capilar de vidrio de borosilicato tirado en un extractor de microelectrodo hasta un diámetro de la punta de 0, 5 – 2 μm. pesadamente Fuego Polaco la pipeta (a menudo hasta que cierre) utilizando un microforge. Coloque con cuidado la pipeta auxiliar perpendicular al eje largo de la nave cerca el extremo abierto con un manipulador mecánico de 3 ejes (ver figura 1). Coloque la pipeta ayudante justo por encima de la nave, pero no tocar lo. Coloque la pipeta de canulación en el extremo abierto del recipiente (ver figura 1 y 2A(i)) utilizando un micromanipulador fina; Coloque la punta inmediatamente adyacente a la abertura, evaluada mediante el ajuste del plano de enfoque en el microscopio (a 20 X). Cuando tanto el final de la nave y la punta de la cánula están enfocadas al mismo tiempo la posición correcta de la cánula para la canulación (ver figura 2A(ii)). Avanzar la cánula de presurización en la abertura del recipiente usando los controles de eje x de la fina instrumental quirúrgico (ver figura 2A(iii)). Evaluar el éxito de la canulación moviendo la cánula a lo largo del eje y. Si la cánula queda en el recipiente es canulado con éxito (ver figura 2A(iv)). Si la cánula se mueve fuera de la nave, la cánula es probable que sea por encima de la embarcación; Si es así, repita paso 2.10-2.11 con la cánula en un plano inferior en el eje z. Con canulación exitosa Baje suavemente la pipeta de ayudante en la embarcación para refrenar la arteriola. Guía de la pared arteriolar en la cánula de presión con la pipeta de ayudante, al mismo tiempo como la pipeta de la canulación se avanza más en el lumen del vaso a una distancia de aproximadamente 30-50 μm (véase la figura 2A(v, vi)).Nota: Este procedimiento requiere movimiento simultáneo y controlado de dos manipuladores (pipeta ayudante hacia la cánula mientras que la cánula se mueve en el lumen del vaso) y se requieren extensa práctica para lograr una alta tasa de éxito. Cambiar la solución de baño normal madejas que contienen 2 mM Ca2 + (véase tabla 1) a 37 ° C. Por lo general esto causa un leve estrechamiento de la arteriola y la formación de un sello hermético alrededor de la cánula de presurización. La pipeta de ayudante entonces alejada de la embarcación. Permite un sello hermético ver el vaso usando una cámara USB (y software de adquisición de imagen) conectado al microscopio y ajustar el enfoque para maximizar el contraste entre los límites de la nave y los espacios externos e intramural (véase a 15 minutos Figura 2B). Imagen de la nave en el 0.5 – 5 marcos/s. Después de 1 minuto de grabación en 0 mmHg, aumentar la presión intraluminal al nivel deseado cerrando el grifo de 3 vías conectado a la cánula de presurización (ver figura 1B) y aplique una pequeña cantidad de presión positiva para el sistema a través de la jeringa. Observar el cambio en el manómetro de la presión.Nota: La presión puede añadirse de manera paso sabio hasta 100 mmHg y un valor por ejemplo 40 mmHg (aproximar la presión arteriolar retiniana en vivo)23. El buque debe dilatar rápidamente confirmando la canulación exitosa. Tenga en cuenta que la vasoconstricción inducida por la presión (es decir, la respuesta miogénica) desarrollarán posteriormente durante un período de 15 minutos, pero debido al pequeño tamaño de estos buques, esto puede no siempre ser visualmente perceptible. Vigilar cuidadosamente el recipiente durante la presurización inicial obvio si hay fugas. Fuentes de escape pueden originarse en ramas laterales troceados o sellado inadecuado de la cánula en el interior de la arteriola. Ver contenido intraluminal dejando el vaso. Fugas más pequeñas, menos obvios pueden ser evidentes con el tiempo como una caída de presión en el manómetro. Si es posible, ocluir la abertura con engobes de alambre de tungsteno adicional teniendo cuidado de no para molestar a la cánula. Excluir preparados con evidente fuga de mayor análisis. Aplique el medicamento de interés abluminally al recipiente antes o siguiente, presurización de 15 min dependiendo de los objetivos del experimento (el anterior permite efectos sobre el desarrollo del tono miógeno debe ser determinada, mientras que este último permite el análisis de los efectos en estado estacionario tono miógeno). Un sistema de entrega de drogas típico está representado en la Figura 3A. Coloque el punto de entrega perpendicular a la porción de recipiente de interés (como se ilustra en la figura 1) a una distancia ~ 500 μm de la nave de interés teniendo la precaución de asegurar que la salida es óptimo angulada para superfuse completamente el área (véase Figura 3B). Aseguran que cambios en la perfusión no molestan físicamente el buque. Tras la realización de un experimento, aplique una solución de 0Ca2 + Hanks’ que contiene 10 μm wortmannin (inhibidor de la cinasa de la cadena ligera de miosina) para máximo dilatar los vasos para determinar el diámetro del pasivo.Nota: La fuerza del sello de la canalización se puede probar en la conclusión del experimento al aumentar la presión intraluminal a > 100 mmHg. La mayoría de buques permanecerá unida incluso a esta alta presión indicando un sello hermético. Cabo análisis fuera de línea con detección de bordes para rastrear cambios en el diámetro arteriolar (véase Tabla de materiales para el software sugerido). Normalizar el diámetro de la arteriola al diámetro pasivo para la comparación entre los vasos. 3. Ca2 + imagen Nota: Arteriolas retinianas aisladas están preparadas para convencional (microfluorimetry) y confocal Ca2 + proyección de imagen como sigue (con el equipo detallado en la Tabla de materiales). Preparar homogenados retiniana en un tubo de ensayo de vidrio de 5 mL como se describe en la sección 1. A 1 mL de homogeneizado de retina añadir Fura-2:00 (microfluormetric Ca2 + grabación) o Fluo-4:00 (Ca2 + proyección de imagen confocal) para dar una concentración final de 5 μm (proteger de la luz); colorantes indicadores cargan preferentemente en las células musculares lisas. Mantener a temperatura ambiente en oscuridad durante 2 h sacudiendo el lado del tubo cada 15-20 min para volver a suspender el tejido retiniano. Posteriormente, diluir el homogenado 1:4 con solución de HCl para reducir la carga de tinte.Nota: Los recipientes permanecen viables por hasta 6 h (cuando se almacena a 4 ° C y en la oscuridad); sin embargo se recomienda que los experimentos se iniciaron tan pronto como sea posible para reducir el impacto de la compartimentalización del tinte en organelos internos o extrusión del tinte con el tiempo. Transferencia de 1-2 mL de homogeneizado de retina a una cámara de grabación con fondo de cristal (parcialmente llenada con LCH) montada en el escenario de un microscopio invertido conectado a un sistema de microscopía confocal o Ca2 + microfluorimetry. Anclar las arteriolas perpendiculares a la dirección del flujo a través de la cámara de grabación, con combinaciones de alambre de tungsteno (50 μm de diámetro, 2-4 mm de longitud) espaciada ~ 100-200 μm aparte a lo largo de la longitud del vaso (ver figura 3) usando una técnica similar a la descrita en el paso 2.3. Inundar el baño con solución de Ca2 + Hanks normal a 37 ° C. Coloque el punto de entrega de drogas como se indica en la figura 3 y aplicar medicamentos a los buques como se describe en el paso 2.17. Para el Ca2 + proyección de imagen convencional, iluminar el vaso con la luz de 340/380 nm a través de un objetivo de inmersión UV de aceite (por ejemplo, 100 X, NA 1.3) y recoger la fluorescencia emitida a 510 nm mediante un fotón contando tubo fotomultiplicador (PMT). Al final de cada experimento, medir la fluorescencia del fondo por Temple el recipiente con una solución que contiene el MnCl (ver tabla 1). Coeficientes de corrección de fondo de la fluorescencia (R-F340/F380) para análisis o convertir al intracelular Ca2 + uso de ([Ca2 +]i) Rmax medidas (ver tabla 1, aplicada antes de amortiguamiento y Rmin 24) y la ecuación de Grynkiewicz25. Para el Ca2 + proyección de imagen confocal, excitar vasos Fluo-4 cargado de 488 nm y captura de las emisiones de fluorescencia resultante a 490 535 nm en cada línea de scan (xt) el modo o modos de exploración xyt (512 x 512 píxeles, agujero de alfiler sugerido 300 nm). Normalizar las mediciones de la fluorescencia en tiempo t = 0s (F/F0). Evaluar los cambios en la [Ca2 +]i durante aplicaciones de drogas o presurización offline en regiones específicas de interés (ROIs) utilizando el software de análisis de imagen. Si es necesario, realizar Ca2 + proyección de imagen con presión miografía.Nota: Las descripciones anteriores se han optimizado para los recipientes sin presión; sin embargo es posible combinar Ca2 + proyección de imagen con presión miografía como sigue. Aislar las arteriolas según sección 1. Carga con tintes de Ca2 + indicador según el paso 3.1-3.2. Transferencia de las arteriolas a la cámara de grabación y canule según la sección 2. Tenga cuidado de limitar la exposición a la luz durante el procedimiento de montaje. Medida de Ca2 + según paso 3.5 o 3.7 por encima. Presurizar el recipiente y repetir la medición de Ca2 +. Medida simultánea del diámetro del vaso es dependiente en el modo de Ca2 + medición y equipo utilizado.Nota: Para la medición de Ca2 + confocal puede ser necesario a la presurización de pre y post de regiones separadas de imagen debido al blanqueo de la dye durante largas exposiciones a la luz. 4. electrofisiología de Patch-Clamp de Nota: Celulares y un canal de grabación es posible de células individuales del músculo liso arteriolar todavía incrustadas dentro de sus arteriolas de la matriz como sigue (con el equipo detallado en la Tabla de materiales). Aislar y arteriolas retinianas en la cámara de grabación de anclaje tal como se describe en los pasos 1, 2,3 y 3,3. Para la grabación de la abrazadera del remiendo, el alambre de tungsteno se desliza es espaciados aparte de 200-800 μm a lo largo de la nave. Retire la lámina basal alrededor de la arteriola y desacoplar eléctricamente las células adyacentes del músculo liso y células endoteliales subyacentes antes de la fijación con abrazadera del remiendo. Para ello, superfuse el buque con una serie secuencial de soluciones enzimáticas (tabla 1) a 37 ° C durante el tiempo necesario.Nota: La duración de la exposición de la enzima está optimizada para las arteriolas retinianos de la rata (proteasa, ~ 8 min; colagenasa, ~ 12 minutos) y depende de la velocidad de flujo del sistema de entrega de drogas (~ 1 mL/min en nuestra instalación) y las actividades de la unidad del lote de las enzimas que se utilizan. Evaluar el nivel de digestión en la separación visual de endotelial y capas de músculo liso durante la colagenasa paso tal como se muestra en la figura 4. Una vez que se observa separación de las capas (como se muestra en la Figura 4B), aplicar DNasa solución (~ 4 min) entonces terminar la digestión por el reemplazo de la solución de baño con solución de Ca2 + madejas normales. Quite cualquier hebra restante de lámina basal y periférica neuropilos barrer cuidadosamente las puntas cerradas de Pinzas finas a lo largo de la superficie del vaso. Tire y Polaco Capillares de vidrio de (Tabla de materiales), llenar con solución (tabla 1) de la pipeta y coloque firmemente en el soporte de la pipeta de la headstage de la abrazadera del remiendo. Coloque la pipeta en un ángulo de 45° en relación con la cámara de grabación y avanzar hacia el vaso usando el ajuste grueso en un micromanipulador motorizado. Seleccione una célula de músculo liso que sobresale de la pared del vaso y cuya superficie está libre de suciedad visible (ver Figura 4B). Coloque la punta de la pipeta patch verticalmente sobre la célula de interés y bajar poco a poco con el movimiento lento bellas de las amalgamas dentales para hacer contacto con la membrana del músculo liso. Evaluar el contacto entre la célula y pipeta visualmente de movimiento celular y un cambio en la resistencia de pipeta medida usando el protocolo de prueba de la membrana (sello) en el software de adquisición (5-10 paso negativo de mV de 0 mV, frecuencia 25 KHz; ver figura 5A(i)) . Cuando la resistencia del sello ha aumentado 5 veces (por ejemplo, pasando de 2 a 10 MΩ; Figura 5A (ii)) se aplica presión negativa transitoriamente a la parte posterior de la titular de la pipeta a través de un conector, grifo de 3 vías, jeringa y tubo atado titular de la pipeta (montado de una manera similar a la utilizada en la presurización de las arteriolas, ver figura 1B). Repetir aplicaciones de presión negativa hasta un gigaseal (> 1 resistencia de GΩ; según lo indicado por la prueba de la membrana en el software de adquisición) es formado (figura 5A(iii)). Tenga en cuenta que este proceso puede tomar de 1 a 5 min. Si un gigaseal no forma, elegir una célula diferente a la abrazadera del remiendo usando una pipeta patch fresco. Aplique una explotación potencial a la celda mediante el software de adquisición según el experimento que se realiza (normalmente 0-40 y -80 mV). Estudiar la actividad de canal único (en celdas) en la configuración actual. Alternativamente, generar parches de adentro hacia fuera rápidamente los tramos la pipeta patch desde la superficie de la célula después de la formación gigaseal. Como los extremos libres de la membrana pueden volver a templar bajo estas condiciones retirar la pipeta del baño a través de rápido movimiento vertical del manipulador (ajuste grueso). Volver rápidamente a través del menisco para quitar la membrana reformada dejando sólo el parche dentro de la punta de la pipeta. La frecuencia de muestreo en el software de adquisición a 5 KHz y activar el modo de grabación continua a la actividad de registro de canal. Aplique los cambios de voltajes si es necesario mediante el software o el amplificador. Si es necesario, se aplican medicamentos a parche de membrana vaso como se describe en el paso 2.17. Si se requiere el estiramiento de la membrana, se aplica presión negativa a la parte posterior de la pipeta con la jeringa unida a un manómetro mediante un grifo de 3 vías y conector. Analizar grabaciones de un canal para probabilidad abierta y conductancia unitaria según procedimientos estándar26. Para toda celda actual grabación pipetas de extracción y pulido según la Tabla de materiales, llenar con solución de pipeta conteniendo anfotericina B (Añadir 3 mg de anfotericina B a 50 μl de DMSO, añadir 3-6 μl de esto 1 ml de solución de la pipeta de la célula entera, someter a ultrasonidos para mezclar) y formar un sello según pasos 4.6-4.9. Debido a la inclusión de la anfotericina B no hay ruptura de la membrana dentro de la punta de la pipeta para obtener acceso de células enteras. Controlar el acceso, que se ganó poco a poco, usando el protocolo de prueba de la membrana en el software de adquisición (paso de-20 mV de -40 mV, frecuencia de muestreo 25 KHz; ver figura 5B). Montaje automatizado de capacitivas transitorios en algunos software da mediciones en tiempo real de acceso a resistencia y capacitancia de la celda (alternativamente la relativa disminución de los transitorios puede evaluarse por el ojo). Una vez que la resistencia de acceso cae a < 15 MΩ, realizar compensaciones de resistencia serie (figura 5) los discos selectores parámetros celulares (resistencia capacitancia y serie) en el amplificador. Para ello, utilice los valores de ajuste automático para configurar inicialmente los cuadrantes (ver figura 5(ii)) entonces incrementar el dial de compensación de la resistencia serie (predicción y corrección si está disponible en el amplificador) volver a ajuste de las compensaciones de células enteras reduciendo la capacitiva transitorios (ver figura 5(iii)). Teniendo cuidado de no sobre compensar (como se muestra en la figura 5(iv)). Por lo general, es posible compensar la resistencia en serie en un 75% en el modo de parche perforado (requiere compensación de lag para ajustarse al máximo). Si no se dispone de ninguna conexión automatizada, comienzan fijando los parámetros celulares marca pF 15 y 15 mΩ (valores típicos para estas células) y luego ajustar para producir las salidas como se muestra en la figura 5(ii). El dial de compensación de la resistencia de la serie ~ 75% de aumento y reajustar los parámetros celulares cuadrantes según la figura 5(iii). Antes de comenzar la experimentación tenga en cuenta la medición de capacitancia celular en el primer ajuste automático o desde el disco después de compensación manual.Nota: Este valor se utiliza para normalizar las corrientes al tamaño de la célula. Compensar la resistencia de serie deba ajustarse durante la experimentación como acceso puede seguir mejorando debido a la incorporación de la anfotericina B en el parche. Aplicar medicamentos a los buques como se describe en el paso 2.17. Aplicar protocolos de voltaje (pasos o rampas) según los requisitos experimentales.Nota: Típico paso los protocolos, 0.1 – 1 s de duración, se aplican de la explotación potencial de 10-20 mV incrementa cada 5-10 s para producir una familia de corrientes activados por voltaje. Como alternativa utilizar protocolos de rampa para medir corrientes en una serie de tensiones en un ‘barrido’ por incrementando lentamente el voltaje (100-200 mV/s) de por ejemplo, -80 a + 80 mV (aplicado cada 5-10 s) con muestreo fuera de línea de la corriente en 10 intervalos de mV durante la rampa. Es posible combinar Ca2 + la proyección de imagen con abrazadera del remiendo como sigue la grabación. Aislar las arteriolas según sección 1. Carga con Ca2 + indicador tintes según pasos 3.1-3.2. Montar en la cámara de grabación según la sección 4. Tenga cuidado de limitar la exposición a la luz durante estos procedimientos.Nota: Hasta la fecha no ha sido posible combinar la abrazadera del remiendo con estudios miografía de presión debido a la pérdida de la membrana basal y la integridad de la embarcación durante el proceso de disociación enzimática