Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Burada açıklanan tüm deneylerin 1986 İngiltere’de hayvanlar (bilimsel yordamlar) hareket içinde yer alan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve Queen’s University Belfast hayvan refahı ve etik İnceleme vücut tarafından kabul edildi. 1. Retina arteriyoller yalıtım Not: Aşağıdaki protokol Retina arteriyoller izole etmek için kullanılır. Bu yöntem sıçan retina arteriyoller için en iyi duruma getirilmiş ancak fare Retina ile kullanılabilir. Gemiler, verim ancak, fare kullanırken düşüktür. Tablo 1′ de gösterildiği gibi Hanks’ (LCH) içeren düşük Ca2 + bir çözüm oluşturur.Not: Bu çözüm 4 ° C’de 3 güne kadar saklanabilir (kullanarak LCH depolandıklarında, oda sıcaklığında sakinleştiği ve pH kullanmadan önce doğru olduğundan emin olun). Koleksiyon doku retina hızlı mikrodiseksiyon emin olmak için önce aşağıdaki ekipman montajı: tırtıklı forseps, eğri makas, diseksiyon çanak (Petri dish silikon kaplı), tek kenarlı bıçak, forseps (kör) 1 cam 2 takım Pasteur pipet (yangın pürüzsüz ama değil dar ucuna kadar cilalı), 1 tek kullanımlık plastik pipet (için diyafram artırmak için kesilmiş uç ile ~ 5-7 mm), 1 cam yuvarlak alt test tüpü (5 mL) ve tutucu. Yaklaşık 50 mL LCH bir cam kabı içine dikkatle boşaltmak ve atık sıvılar dikkatle boşaltmak için ikinci bir ölçek hazırlamak.Not: Malzemeler tablo özellikleri ve üretici Ayrıntılar için bkz. Exsanguinate için kalp ponksiyon tarafından takip CO2 kullanarak fare ötenazi (servikal yerinden çıkması veya beyin sarsıntısı Bunlar kan damarları gözüne zarar verebilir önlemek). Göz kapaklarının tırtıklı forseps ile geri çek, sonra çevresinde yörünge kasları ve optik sinir aracılığıyla kesmek için eğri makas kullanın. Yavaşça gözlerini kalan herhangi bir ek makasla kesmek için dikkat çekici yörüngeden ayıklayın. LCH çözüm (gözleri buz LCH bir çözümde gerekirse taşınmış) diseksiyon çanak üzerinde dalmış gözler yerleştirin. Yörünge kas ekler veya optik sinir tutarak çanak gözle tutturmak künt forseps kümesi kullanın; bağlantı noktası göz dengelemeye sklera mümkün olduğu kadar yakın olduğundan emin olun. Bıçak kullanarak, kornea ora serrata boyunca kesti ve forseps ile sklera üzerinde hafifçe basarak objektif kaldırın. Göz Kupası optik disk üzerinden simetrik olarak ikiye kesin. Kullanarak forseps yavaşça ‘fırça’ Retina optik disk, kalan ekleri kaldırmak için dikkat çekici kadeh iki yarısı üzerinden dışarı kapalı. İkinci göz ile işlemi tekrarlayın ve disseke Retina tüp LCH orta plastik pipet ve küçük bir damla kullanarak içine aktarın. Plastik pipet kullanarak doldurmak için LCH ile test tüpü ~ 5 mL ve Retina altına yerleşmek izin verir. Doku yaklaşık yıkama 3 kez kaldırarak ~ 4 mL tüp ve taze LCH plastik pipet kullanarak ekleme çözeltisi. Gerekli hallerde, suspensory bağ, vitre mizah ve kıllar gibi yabancı dokuyu. İç cam Pasteur pipet (cilalı ucu) doku için pipet yapışmasını önlemek için LCH ile yıkayın. Aynı pipet kullanarak, çözüm yaklaşık 4 mL tüp kaldırın. Daha sonra yaklaşık 2 mL taze LCH ekleyin. Yavaşça (triturate) ayırmak doku cam ucu ile çizerek Retina yavaş yavaş pipet ve içeriği tüp sınırdışı. Not, bu aşamada kabarcıklar tanıtmak değil deneyin. Retina yaklaşık 2-3 mm2boyutuna kadar kırık kadar 1,10 tekrarlayın. Pipet iç LCH yaklaşık 2 mL ile yıkama ve bu tüp sınırdışı. İçeriği üzerinde 5-10dk alt yerleşmek izin verir. Toz doku parçaları boyutu yaklaşık2 1 mm kadar 1.10-1.12 biraz daha fazla bir güçle içinde özetlenen adımları tekrarlayın. Yine, doku 5-10dk için yerleşmek izin verir. 1.10-1.12 adımları yineleyin üçüncü kez daha fazla bir güçle içeriği tam olarak homojen ve retina no adet kalması kadar (Çözüm Görünümü sütlü olacaktır).Not: Bu teknik 8 arteriolare kesimleri (nispeten neuropile çevreleyen ve sağlam kalan bazı dalları ile ücretsiz) verecektir çapı ve 200-2500 µm uzunluğu 8-45 µm ölçme yalıtım başına. Fizyolojik kayıt odasına izole küçük bir miktar aktarabilir veya floresan boyalar intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +]i; bkz: Bölüm 3) ölçümü için ekleyin. Kalıntıları göz bardak ve hayvan atıkları işleme yerel kurallara uygun yalıtım işlemi sırasında kaldırıldı çözüm atın.Not: Bu gemiler üzerinde yalıtım sonra hemen denemek için tavsiye edilir iken, ihtiyaç fazlası izole etmek en fazla 8 saat için 4 ° C’de depolanabilir. 2. arterioler basınç Myography Not: Arterioler basınç myography donanımları ayrıntılı Şekil 1A, B ve Malzemeler tabloaşağıdaki gibi kullanarak yapılır. Retinal damar homogenate bir aliquot transferi (1-2 mL; 1 bölüm başı olarak izole) fizyolojik kayıt odasına (kısmen sözde dolu Ca2 +ücretsiz Hanks çözüm; 0Ca2 + Hanks’; bkz. Tablo 1) sahnede monte bir ters mikroskop. En az 5 dk önce deneme için kayıt odası dibinde yerleşmek için gemiler bırakın. Arteriyoller > 200 µm uzunluğu ve hangi aracılığıyla damar cannulated bir açık uçlu sahip tanımlamak için kayıt odası arasında görsel olarak tarayın (gemi tipi kimliği daha da sonuçları bölümünde araştırdı). Gemi görüş alanı ortasına yerleştirin. Uygun hiçbir gemi varsa, gemi homogenate başka bir aliquot adım 2.1 göre kayıt odasına aktar. İyi forseps ve küçük tungsten tel slip kullanarak gemi bir ucunu çapa (75 µm çapı ve ~ 2-4 mm uzunluğunda) gemi yerleştirilir (bkz. Şekil 1 c(i)). Bunu yapmak için tel forseps tutun ve forseps kayıt odası bulun. Mikroskop altında forseps karşılık gelen gölge tanımlamak, Tel belirgin hale gelinceye kadar forseps banyo içine düşmüş olursun. Tel açık sonundan itibaren gemi yaklaşık 200 µm üzerine getirin ve gemi uzun eksenine dik tel bırakın.Not: Tungsten tel ağırlığını klemple luminal içeriği akışını durdurma cannulation ve basınçlandırma sırasında gemi doldurmak için yeterli olur. Öyle ki yatay olarak banyo arasında açık uçlu doğrultusunda basınçlandırma kanül ile yatıyor arteriyol kayıt odası içinde uygun bir pozisyona taşımak (bkz. Şekil 1 c(II-IV)). Bunu nazikçe occluding tungsten tel notu tel forseps içinde düzenlenen yeni bir bölüm ile hafifçe hareket ettirme tarafından; geri dönüşümsüz forseps için uygun olacaktır gibi arteriyol dokunmayın. Öyle ki gemi tehlikesi ve açık uçları arasındaki mesafe en fazla 200 µm (uzun arteriyol segmentler için) gerektiğinde, ek tungsten tel fişleri üzerinde gemi ekleyin; Bu basınçlandırma üzerine görüş alanı dışında hareketli arteriyol önlemeye yardımcı olur. Geminin herhangi bir yan dallar varsa, bunlar da ek tungsten tel torbalarla tıkandı. Eğer bir yan dal tıkandı gemi atmak. Odası ile 0Ca2 + Hanks’ 37 ° C’de yabancı Retina dokuyu ve fizyolojik sıcaklıklara banyo sıcak sıvı.Not: Bir standart yerçekimi beslenen banyo perfüzyon ve satır içi kalorifer sistemi bu amaç için kullanılabilir ( Şekil 1A’ ya bakınız). 0Ca2 + Hanks’cannulation yordamı kolaylaştırmak için kullanılır, dış Ca2 + sağlar kaldırılması beri arteriyoller dilate kalır. Basınçlandırma kanüller filamented borosilikat cam kılcal damarlar (uç çapı ~ 3-10 µm cannulated için damar çapı göre; dar kanüller gerektirir; Tablo reçetesibakın daha küçük damarları) dan imal kullanarak bir Elektrot puller ve arka-dolgu 0Ca2 + Hanks çözümü ile. Kanül şaft cannulation kolaylaştırmak için belgili tanımlık uç doğru hafifçe konik emin olun. 10 mL şırınga Y konektörü ve bir 3’lü musluk üzerinden bağlı bir pipet tutucu kanül mount; Bu sistem baskı yapmak, diğer yan-kol için Y ucunun bağlı bir manometre kullanarak kaydedilen baskı için kullanılır (bkz. Şekil 1B).Not: ‘Yardımcı’ pipet cannulation işlemine yardımcı olmak için gereklidir. Pipet borosilikat cam kılcal bir elektrot çektirmenin bir uç çapı 0,5 için çekti imal – 2 µm. ağır ateş Lehçe pipet (kez kapatılıncaya kadar) bir microforge kullanarak. Dikkatle yardımcı pipet gemi uzun eksenine dik açılarla yakın 3 eksenli mekanik manipülatör kullanarak açık ucuna yerleştirin (bkz. Şekil 1 d). Yardımcı pipet hemen üstünde gemi ama değil dokunaklı getirin. Cannulation pipet, gemi açık sonuna yerleştirin (bkz: Şekil 1 d ve 2A(i)) kullanarak iyi bir micromanipulator; Açılış, hemen bitişik uç mikroskop (at 20 X) odak düzlemi ayarlayarak değerlendirildi olarak yerleştirin. Ne zaman her iki sonuna gemi ve kanül ucu olan odakta kanül doğru yerleştirilmiş aynı anda cannulation için (bkz. Şekil 2A(II)). Basınçlandırma kanül iyi micromanipulator x ekseni denetimlerini kullanarak gemi diyafram önceden ( Şekil 2A(III) bakın). Cannulation başarısı kanül y ekseni boyunca hareket ettirerek değerlendirmek. Başarılı bir şekilde cannulated (bakınız Şekil 2A(IV)) ise kanül gemi içinde kalır. Kanül geminin dışında hareket ederse, kanül gemi olması muhtemeldir; Eğer öyleyse adım 2.10-2,11 alt uçağa z ekseni, kanül ile yineleyin. Başarılı cannulation yardımcı pipet arteriyol dizginlemek için gemi üzerine yavaşça indirin. Arterioler duvar rehberlik cannulation pipet gelişmiş yardımcı pipet ile basınçlandırma kanül üzerinden aynı anda gemi lümen yaklaşık 30-50 µm bir mesafe içine daha da ( Şekil 2A(v, VI) bakın).Not: Bu yordam için her iki manipülatörler (yardımcı pipet kanül gemi lümen hareket ederken doğru kanül hareketli) aynı anda, kontrollü hareket gerekir ve yüksek başarı oranı elde etmek için geniş uygulama gerektirir. 2 mM Ca2 + içeren normal Hanks için banyo çözüm değiştirin (bkz. Tablo 1) 37 ° C’de Genellikle bu bir hafif daralma arteriyol ve basınçlandırma kanül çevresinde sıkı bir mühür oluşumu neden olur. Yardımcı pipet gemi uzak taşınabilir. 15 dk. bir USB kamera (ve görüntü alma yazılımı) kullanarak gemi için mikroskop bağlı ve gemi sınırları ve (bkz: dış ve intraluminal alanlarda arasındaki kontrast en üst düzeye çıkarmak için odak ayarlamak görünümü geliştirmek için sıkı bir mühür izin Şekil 2B). 0,5 – gemisine resim 5 kare/s. Kayıt 0 mmHg, 1 dk sonra basınçlandırma kanül bağlı 3’lü musluk kapatarak istenen seviyeye intraluminal basınç artışı (bkz. Şekil 1B) ve pozitif basınç az miktarda şırınga ile sisteme uygulanır. Manometre üzerinde değiştirmek basınç gözlemlemek.Not: Basıncı 100 mmHg kadar veya bir değer bir adım akıllıca moda örneğin 40 mmHg (Retina arterioler basınç vivo içindeyaklaşıldığıdır)23eklenebilir. Gemi hızla başarılı cannulation teyit genişletmek. Lütfen dikkat, basınç kaynaklı vazokonstriksiyona (Yani, myogenic yanıt) daha sonra bir 15 dk boyunca gelişecektir ama bu gemiler küçük boyutu nedeniyle, bu her zaman görsel olarak tespit olmayabilir. Dikkatle gemi açık kaçakları için ilk basınçlandırma sırasında izleyebilirsiniz. Kaynaklarının sızıntı i ciddi yan dalları veya kanül yetersiz mühürleme arteriyol içeriye doğru kaynaklanan. Gemiyi terk intraluminal içeriği için dikkat et. Manometre üzerinde baskı bir düşüş olarak zaman içinde daha küçük, daha az belirgin sızıntı belirgin hale gelebilir. Mümkünse, açılış kanül bozmamaya dikkat çekici ek tungsten tel torbalarla doldurmak. Hazırlıklar belirgin sızıntı ile daha fazla çözümleme dışı bırakmak. Gemi önce veya aşağıda, (eski ikinci etkileri analizine olanak sağlarken, belirlenecek myogenic sesi gelişimi üzerinde etkileri sağlar deneme 15dk basınçlandırma amaçlarına bağlı olarak faiz abluminally uyuşturucu uygulamak kararlı durum myogenic sesi üzerine). Tipik uyuşturucu dağıtım sistemi Şekil 3Aresmedilmiştir. Gemi ilgi bölümüne dikey teslim çıkış ( Şekil 1 diçinde gösterildiği gibi) bir mesafede pozisyon ~ 500 µm sağlamak için dikkat çekici faiz gemi uzak çıkış en iyi şekilde olduğunu tam olarak superfuse için (bkz: alan açılı Şekil 3B). Perfüzyon değişimler fiziksel olarak gemi rahatsız değil emin olun. Bir deney tamamlanmasını takiben, sonuna kadar pasif çapı belirlemek için gemi genişletmek için 10 µM wortmannin (myosin hafif zincir kinaz inhibitörü) içeren bir çözüm 0Ca2 + Hanks geçerli.Not: Cannulation mühür gücünü deneme sonucunda intraluminal basınç yükselterek test edilebilir > 100 mmHg. Damarları çoğunluğu sıkı bir mühür gösteren bile bu yüksek basınçta ekli kalır. Arterioler çapı değişiklikleri izlemek için kenar algılamayı kullanarak çevrimdışı çözümlemeler ( Tablo malzemeler için önerilen yazılım bakın). Gemiler arasında karşılaştırma için pasif çapı için arteriyol çapı normale. 3. Ca2 + görüntüleme Not: İzole Retina arteriyoller geleneksel (microfluorimetry) için hazırlanır ve takip olarak görüntüleme confocal Ca2 + ( Tablo malzemelerikonusunda ayrıntılı cihazlar kullanılıyor). Retina homogenates 5 mL Cam tüp içinde 1 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın. Retina homogenate için 1 mL Fura – 2 AM (microfluormetric Ca2 + kayıt) veya Fluo – 4 AM (confocal Ca2 + görüntüleme) 5 mikron son bir konsantrasyon vermek ekleyin (ışıktan korumak); boya göstergeleri tercihen düz kas hücreleri yüklemek. 2 tüp tarafında flicking h için karanlıkta oda sıcaklığında Retina doku yeniden askıya almak için her 15-20 dk korumak. Bundan sonra homogenate 1:4 yükleme boya daha da azaltmak için LCH solüsyonu ile oranında seyreltin.Not: Kaplar (4 ° C’de ve karanlıkta saklandığında) 6 saat için uygun kalır; Bu deney en kısa zamanda iç organelleri boya compartmentalization veya zamanla boya ekstrüzyon etkisini azaltmak için başladı önerilir. 1-2 mL Retina homogenate, sahne alanı’ndaki bir Ca2 + microfluorimetry veya confocal mikroskobu sistemine bağlı bir ters mikroskop monte edilmiş bir cam popolu kayıt odası (LCH ile kısmen dolu) aktarın. Çapa arteriyoller akış yönünü dikey aralıklı kayıt odası arasında tungsten tel paket fişi (50 µm çapı, 2-4 mm uzunluğunda) ile ~ 100-200 µm gemi uzunluğu boyunca ayrı (bkz. Şekil 3 c) için açıklanan benzer bir teknik kullanarak 2.3. adımda. Normal Ca2 + Hanks çözüm 37 ° C’de banyo sıvı Uyuşturucu teslim çıkış gibi Şekil 3 c resimde getirin ve uyuşturucu 2.17 adımda açıklanan gemiler için geçerli. Geleneksel Ca2 + görüntüleme için gemi ile 340/380 nm ışık objektif bir petrol daldırma UV (Örneğin, 100 X, NA 1.3) ile aydınlatmak ve 510, verilmiş floresans toplamak üzerinden photomultiplier tüp (PMT) sayma bir foton nm. Her deneme sonunda MnCl içeren bir çözüm ile gemi Şoklama tarafından arka plan floresans ölçmek (bkz. Tablo 1). Arka plan-düzeltilmiş floresans oranları (R-F340/F380) çözümlemesi için kullanma veya intrasellüler Ca2 + ([Ca2 +]i) kullanarak dönüştürmek Rmin ve RMaksimum ölçümleri (bakınız Tablo 1; Şoklama uygulanan öncesinde 24) ve Grynkiewicz eşitlik25. Confocal Ca2 + görüntüleme için Fluo-4 yüklü gemiler heyecanlandırmak 488 nm ve yakalama modu (xt) veya xyt tarama modları (512 x 512 piksel; önerilen iğne deliği 300 nm) sonuç floresans emisyon çizgisini 490-535 nm, tarama. Zaman t kaydedilen floresan için ölçümleri normale 0s (F/F0) =. [Ca2 +]i herhangi bir değişiklik ilaç uygulamaları veya görüntü analiz yazılımı kullanarak basınçlandırma çevrimdışı belirli bölgelerde ilgi (ROIs) sırasında değerlendirmek. Gerekirse, Ca2 + görüntüleme basınç myography ile gerçekleştirin.Not: Yukarıdaki açıklamalar basınçsız kapları optimize edilmiştir; Ancak Ca Imaging2 + basınçla myography aşağıdaki gibi birleştirmek mümkündür. Bölüm 1 göre arteriyoller yalıtmak. Ca2 + göstergesi boya göre adım 3.1-3.2 yükleyin. Kayıt odasına arteriyoller aktarmak ve 2 bölüm başı olarak cannulate. Montaj işlemi sırasında ışığa maruz kalma sınırı için dikkat ediniz. CA2 + 3.5 ya da 3.7 yukarıda adım başı olarak ölçmek. Gemi baskı yapmak ve ölçüm Ca2 +. tekrar Gemi çapında eş zamanlı ölçüm cihazları ve Ca2 + ölçüm modu bağlıdır.Not: confocal Ca2 + ölçüm için boya uzun pozlama sırasında gün ışığına ağartma nedeniyle görüntü ayrı bölgeler öncesi ve sonrası basınçlandırma gerekli olabilir. 4. yama-kelepçe Elektrofizyoloji Not: Bütün hücreli ve tek kanallı kayıt ( Tablo malzemelerikonusunda ayrıntılı donanımları kullanarak) aşağıdaki gibi onların üst arteriyoller içinde gömülü bireysel arterioler düz kas hücreleri hala mümkündür. İzole ve Retina arteriyoller kayıt odasında 1, 2,3 ve 3.3 adımlarda açıklandığı gibi çapa. Yama-kelepçe kaydı, gemi 200-800 µm ayrı paket fişi olan tungsten tel aralıklı. Bazal lamina arteriyol çevreleyen kaldırmak ve elektrikle bitişik düz kas hücreleri ve yama sıkma önce altta yatan endotel hücreleri Böl. Bunu yapmak için superfuse enzim çözümleri (Tablo 1) için gerekli süre 37 ° C’de sıralı bir dizi ile gemi.Not: Enzim pozlama süresi için fare Retina arteriyoller getirilmiştir (proteaz, ~ 8 min; collagenase, ~ 12 dk) ve ilaç dağıtım sistemi (~ 1 mL/dk yapımız) akış hızı ve kullanılan enzimler toplu birim faaliyetleri bağlıdır. Sindirim endotel, görsel renk düzeyini değerlendirmek ve Şekil 4gösterildiği gibi düz kas katmanları collagenase sırasında adım. Hücre katmanları ayrılması ( Şekil 4B’ de gösterildiği gibi) gözlenen sonra DNaz başvuruda ben çözüm (~ 4 dk) sonra yerine normal Ca2 + Hanks çözüm ile banyo çözümün tarafından sindirim sonlandırmak. Bazal lamina ve/veya periferik neuropile kalan herhangi bir ipliklerini dikkatle gemi yüzeyi boyunca iyi forseps kapalı ipuçları süpürme tarafından kaldırın. Çekin ve Lehçe cam kılcal damarlar (Tablo malzemeler), pipet çözüm (Tablo 1) ile doldurun ve güvenli bir şekilde yer yama-kelepçe headstage pipet tutucu. Kayıt odası ile ilgili olarak 45 ° açıyla pipet getirin ve kaba ayarı üzerinde motorlu bir micromanipulator kullanarak gemi doğru ilerlemek. Damar duvarından çıkıntılı bir düz kas hücre seçin ve kimin yüzeydir görünür enkaz ücretsiz (bkz. Şekil 4B). Yama pipet ucu dikey olarak faiz hücrenin üzerine getirin ve yavaş yavaş yapmak micromanipulator güzel/yavaş hareketi kullanarak alt düz kas zarı ile temas. Hücre ve hücre hareketi ve edinme yazılımındaki membran (mühür) test protokolü kullanarak ölçülen pipet direnç değişikliği gelen görsel olarak pipet arasında temas değerlendirmek (5-10 mV 0 negatif adımından mV, frekans 25 KHz; bkz: Şekil 5A(i)) . Ne zaman mühür direnç 5-fold artmıştır (rising 2 10 MΩ için;Örneğin, Şekil 5A (II)) uygulamak negatif basınç geçici pipet sahibi arkasına bir y-bağlayıcı, 3’lü musluk, şırınga ve pipet sahibine bağlı boru üzerinden (arteriyoller basınçlandırma içinde kullanılan için benzer bir şekilde monte, Şekil 1Bbakın). Negatif basınç uygulamaları bir gigaseal kadar tekrarlayın (> satın alma yazılım membran testinde gösterildiği gibi 1 GΩ direnç;) olduğunu (Şekil 5A(III)) kurdu. Not, bu işlem 1-5 dk sürebilir. Bir gigaseal forma başarısız olursa, bir taze yama pipet kullanarak düzeltme eki kelepçe için farklı bir hücre seçin. Bir holding potansiyel hücre gerçekleştirilen deneme (genellikle 0, -40 veya-80 mV) göre satın alma yazılımı ile uygulanır. Çalışma (tarih-hücre) tek kanal aktivite mevcut yapılandırma. Alternatif olarak, Inside-out yamalar hızla yama pipet hücre yüzeyinden gigaseal oluşumu sonra geri çeker tarafından oluşturmak. Membran ücretsiz biter bu koşullar altında yeniden TAV gibi pipet banyo manipülatör (kaba ayarı) hızlı dikey hareket üzerinden kaldırın. Yalnızca düzeltme pipet ucu içinde bırakarak reform membran kaldırmak için menisküs aracılığıyla hızla geri. Satın alma yazılım 5 kHz örnekleme frekansı ayarla ve sürekli çekim moduna kayıt kanal etkinlik için harekete geçirmek. Yazılım veya amplifikatör ile gerekli voltaj değişiklikleri uygulayın. Gerekirse, uyuşturucu 2.17 adımda anlatıldığı gibi gemi/membran yama için geçerlidir. Membran streç gerekiyorsa, bir manometre 3’lü musluk ve y-bağlayıcı üzerinden bağlı Ģırınga kullanarak pipet arka için negatif basınç uygulayın. Tek kanallı kayıtları açık olasılık ve üniter gürültülerinden uygun olarak standart prosedürler26için analiz. Tüm cep telefonu için çekme ve Lehçe pipetler Malzemeleri masabaşı olarak kayıt geçerli, Amfoterisin B içeren pipet çözüm ile doldurun (amfoterisin b 3 mg DMSO 50 µL için Ekle; 3-6 µL bu bütün hücreli pipet çözüm için 1 mL ekleyin; karıştırmak için solüsyon içeren temizleyicide) ve bir mühür adımları 4.6-4,9 göre oluşturur. Amfoterisin B eklenmesi nedeniyle tüm cep telefonu erişim kazanmak için pipet ucu içinde membran rüptürü için gerek yoktur. İzlemek erişim, yavaş yavaş, edinme yazılımındaki membran test protokolü kullanarak elde (-20 mV -40 adımından mV, örnek frekans 25 KHz; bkz: Şekil 5B). Bazı yazılım kapasitif geçişler otomatik sığdırma erişim direnci ve hücre kapasite (alternatif olarak geçişler göreli düşüş göz tarafından tespit edilebilir) gerçek zamanlı ölçümler verir. 15 < MΩ erişim direnci düşer sonra tüm hücreli parametre aramalar (kapasitans ve seri direnç) üzerinde amplifikatör kullanarak seri direnç tazminatlar (Şekil 5C) gerçekleştirin. Bunu yapmak için başlangıçta (bkz. Şekil 5C(II)) aramalar ayarlamak için otomatik sığdırma değerleri kullanın sonra seri direnç tazminat arama (tahmini ve düzeltme amplifikatör üzerinde varsa) artırmak tüm cep telefonu tazminatlar yeniden ayarlama Kapasitif geçici azaltırken (bkz. Şekil 5C(III)). Değil telafi etmek üzerinden ( Şekil 5Ciçinde (IV) gösterildiği gibi) için dikkat çekici. Tipik olarak, seri direnç (en yüksek seviyede ayarlamak için gecikme tazminat gerektirir) delikli yama modunda 75 oranında telafi etmek mümkündür. Bütün hücre parametreleri 15 pF ve 15 mΩ (Bu hücreler için tipik değerler)’i arar ve sonra Şekil 5Ciçinde (II) gösterildiği gibi çıktıların üretmek için ayarlamak ayarı tarafından hiçbir otomatik sığdırma kullanılabilirse başlat. Seri direnç tazminat arama ~ artırmak ve bütün hücreli parametreleri aramalar Şekil 5C(III) göre yeniden ayarlayabilirsiniz. Deney başlıyor önce el ile tazminat sonra hücre kapasitans ölçüm ilk otomatik sığdırma veya arama unutmayın.Not: Bu değer hücre boyutu akımları normalleştirmek için kullanılır. Seri direnç için tazminat olarak erişim daha fazla Amfoterisin B ortaklığın yama içine nedeniyle geliştirmek devam deneme sırasında ayarlanması gerekebilir. Uyuşturucu 2.17 adımda anlatıldığı gibi gemiler için geçerlidir. Gerilim protokolleri (adımları veya rampalar) deneysel ihtiyaçlarına göre uygulanır.Not: Tipik gerilim adım iletişim kuralları, 0.1 – 1 s süresi, holding üzerinden uygulanan potansiyel olarak 10-20 mV artırır bir aile gerilim-harekete geçirmek akıntılarının üretmek için her 5-10 s. Alternatif olarak yavaş yavaş gerilim ramping tarafından akımları gerilim bir ‘tarama’ bir dizi, ölçmek için rampa protokolleri kullanın (100-200 mV/s) üzerinden Örneğin, -80 için + 80 mV (her 5-10 s uygulanan) geçerli rampa sırasında çevrimdışı örnekleme 10 mV aralıklarla ile. Ca2 + görüntüleme düzeltme eki aşağıdaki gibi kayıt tipi kelepçe ile birleştirmek mümkündür. Bölüm 1 göre arteriyoller yalıtmak. Ca2 + göstergesi boya adımları 3.1-3.2 göre yükleyin. Bölüm 4 başına kayıt odasında bağlayın. Bu işlemler sırasında ışığa maruz kalma sınırı için dikkat ediniz.Not: Bu bugüne kadar yama-kelepçe enzimatik ayrılma işlemi sırasında basınç myography çalışmaları nedeniyle membran ve beden bütünlüğü kaybı ile birleştirilmesi de mümkün olmamıştır