Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital
Summary
Burada yörünge sallayarak ile hücresel toplamları kültürleri süspansiyon için özel gemiler, O şeklinde kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çantanın içinde yetiştirilen HEK293 hücreleri daha fazla form bu geleneksel kültür damarlarının yetiştirilen daha homojen toplamları.
Abstract
Memeli hücre toplamları kültürleri süspansiyon tıbbi ve biyoteknolojik alanlarında çeşitli uygulamalar için gereklidir. Tek kullanımlık poşet tabanlı yöntemi bir hücresel toplamları seri üretim için basit teknikleri, ancak kültür kültür gemi alt ortasına de toplanıp oluşan aşırı toplama karşı koruma sağlamaz. Bu sorunu çözmek için O şeklinde bir çanak ve ikisi de bir merkez bölgesi içeren bir O şeklinde çanta geliştirdi. Ya O şeklindeki kültür gemi yetiştirilen toplamları boyutunda belirgin bir şekilde daha düzgün daha geleneksel damarlarının yetiştirilen toplamları. Histolojik analizler bu geleneksel kültür yemekleri toplar gösterdi nekrotik çekirdek büyük olasılıkla bir zavallı oksijen kaynağı tarafından neden olduğu yer. Buna ek olarak, O şeklinde çanta, hatta geleneksel kültür yemekleri, toplamları için benzer çaplarda yetiştirilmiştir toplamları nekrotik çekirdek belli etmedi. Bu sonuçlar O şeklinde çanta çanta malzeme oksijen geçirgenliği nedeniyle toplamları için yeterli oksijen sağlar öneririz. Biz, bu nedenle, bu roman gaz geçirgen O şeklindeki kültür çanta çeşitli biyoteknolojik alanlarında gerekli olan üniforma toplamları seri üretim için uygundur öneriyoruz.
Introduction
Süspansiyon hücre kültürü bir önemli rol oynar rejeneratif tıp1 ve Rekombinant protein üretim2 hücre üretimi büyütmek ve bazen 10’dan fazla7 hücre kadar yüksek hücre yoğunluğu elde etmek kolaydır çünkü / mL5. Çin hamster Over (CHO)3 hücreleri ve insan embriyonik böbrek hücreleri 293 (HEK293)4 süspansiyon kültüründe yetiştirilen ve insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için süspansiyon kültür sistemlerindeki büyümüş son zamanlarda yeniden üretim terapiler1,6,7. Süspansiyon kültürler kullanımı gelecekte artması beklenmektedir.
Süspansiyon kültür, bazı hücre hatları tek hücreler olarak büyümek değil ve bu nedenle, toplamları oluşturması gerekir. Örneğin, hPSCs süspansiyon koşullarda toplamları kurma olmadan hayatta kalamaz. Ancak, bu gereksinim için toplanan büyüme tek tip süspansiyon kültürler için zorluklar sunar. Bir zorluk süspansiyon kültür8verimliliğini belirler ve kültürünün erken dönemde Tekdüzen toplamları oluşumdur. Başka bir zorluk içine toplamaları besinlerin kitle Transfer’dir. Özellikle, oksijen kaynağı toplamları en büyük boyutunu sınırlar ve zavallı bir oksijen nekroz toplamları9ortasında neden olur. Sonuç olarak, hücre toplamları kültürleri süspansiyon daha geleneksel süspansiyon kültürleri elde etmek zordur. Yine de, süspansiyon kültürler için çok önemlidir biyomedikal ve biyoteknoloji uygulamaları.
Yörünge sallayarak damarları kültür orta karışımları fan ajitasyon olmadan elde basit süspansiyon kültür sistemleri biridir. Hücre hasarı ve farklılaşma neden olur çünkü kesme stres fan ve dinamik orta akış süspansiyon kültürünün önemli sorundur. Ajitasyon daha düşük bir makaslama stres ile elde etmek için araştırmacılar ve Sanayi yörünge sallayarak geminin sistemleri2,10çeşitli geliştirdik.
Ancak, geleneksel kültür damarları kültürler sallayarak orbital için tasarlanmamıştır. Damarları sallayarak, orbital içinde hücre hücre inhomogeneous toplama neden “Einstein’ın çay yaprak paradoksu”11, bilinen orta akış türüne göre gemilerin merkezi-dibe doğru çekilmek. Dairesel akış merkezkaç kuvveti ve kültür orta ve bir gemi arasında sürtünme nedeniyle, hücre merkezi11,12süpürür. Buna ek olarak, geleneksel kültür çanta kitle kültürü için kare şeklinde, hangi yörünge sallayarak için uygun değildir.
Bu çalışmada, kültürler sallayarak orbital için uygun bir roman kültür çanta geliştirdik. Bu çanta yenilik hücre alt merkezi bölge toplantıda engellenir bu yüzden Merkezi bölge yok onun O şekli olmasıdır. Biz de bu gemi biyoteknolojik uygulamaları için bu çanta olasılığını göstermek için bir HEK293 kültür ile işlenmesi göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada gemiler O şeklinde geliştirilen ve bir HEK293 süspansiyon kültürü içinde gerçekleştirilen bir üniforma toplamları oluşumu ve genişleme için. Biz O şeklindeki gemiler (Şekil 1) tek tip toplamları gözlenen ise geleneksel kültür tabakta kültür sallayarak bir orbital toplamları, iki farklı çaplarda üretilen. Yörünge sallayarak koşullarında lekeli boncuk dağıtımını gözlem göre boncuk bir geleneksel kültür tabak merkezi-alt toplamak. Bu toplama muhtemelen toplamları çeşitli boyutlarda önde gelen hücre yoğunluğu farklılığı neden oldu. Alternatif olarak, boncuk merkezi-alt bölge (Tamamlayıcı Şekil 1) sahip olmayan O şeklindeki yemeği dağıtıldı. Bu dağıtım muhtemelen O şeklindeki damarlarının birörnek boyutlu toplamları neden olur. Başka bir — yaygın olarak kullanılan — Tekdüzen toplamları üreten yaklaşımdır microwells içinde kültür ama bu yaklaşımın bazı sorunlar gibi dışarı microwells13bırakarak toplamları olmadan bir kültür ortamı sağlamak vardır. O şeklindeki gemiler söz konusu olduğunda, tek tip toplamları bir basit süspansiyon kültürde üretilebilir.
Kültür sallayarak orbital memeli hücreleri için kullanılan bir popüler kültür sistemidir. Karıştırılmış tank biyoreaktör14, dalga işaret etti çanta15, gibi memeli hücrelerinin seri üretim için çeşitli kültür Yöntem vardır ve şişe döner. Yörünge sallayarak kültürler orta karıştırma için bir iç fan dahil değildir, karıştırılmış tank biyoreaktör yapar. Bu özellik, çanta dalga işaret etti ve dönen şişe benzer. Bu fan-Alerjik kültür sistemleri çarklar çevreleyen kesme kuvvetleri hücresel hasarı önlemek ve düşük kesme stres süspansiyon kültürü farkındayız. Özellikle, yörünge sallayarak kültür sistemleri kendi yüksek ölçeklenebilirlik ve düşük kesme stres nedeniyle memeli hücreleri gibi duyarlı hücrelerin seri üretim için etkilidir.
Gemiler O şeklinde yörünge sallayarak kültür toplamları oluşumunda kalan sorunu artırabilir. Kültür sistemleri sallayarak, orbital içinde yüzen hücreleri “Einstein’ın çay yaprak paradoksu”11bilinen gemi, alt ve merkezi göç. Bu inhomogeneous toplama ve düzgün olmayan toplu üretim geleneksel orbital damarları sallayarak neden olabilir. Bu çalışmada, hücre konsantrasyonu dibine Merkezi-hangi Tekdüzen toplama yörünge titreyen O şeklindeki damarlarının nedeni olarak düşünülmektedir gemiler, gemiler O şeklindeki engelledi.
Histolojik analizler geleneksel çanak toplamları denucleated hücrelerin (Şekil 2a) bulunan gösterdi. Buna ek olarak, denucleated hücreleri toplamları O şeklindeki gemiler (Şekil 2b ve 2 c) içinde görünmedi. Bu denucleated hücreleri glikoz, glutamin ve oksijen9gibi yüzeylerde yetersizliğinden kaynaklandığını mümkündür. Boyutu ölçüm göre homojen çapları 400 µm alt toplamları O şeklindeki damarları vardı. Buna ek olarak, geleneksel bir yemek, bazı toplamları 400 µm büyük bir çap vardı ve denucleated hücreleri bu toplamları dahil. Bu sonuç O şeklindeki damarlarının homojen ölçekli toplamları oluşturma toplamları kalite kontrolünde etkili olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda gaz geçirgen polietilen film ile oksijenasyonu O şeklinde çanta içinde denucleated hücrelerinin görünümü engelledi düşünülmektedir.
Bu deneyler bu O şeklindeki gemiler olasılığı Tekdüzen toplamları üretmek için basit bir sistem olarak gösterdi. Diğer kültür çanta süspansiyon kültürü için Gelişmiş15olmasına rağmen o kültür çantaları etkili yörünge sallayarak karışık alıyorum gelen kültür engelleyen kare şeklindeki. Bu çalışmada çantada yuvarlak şekil için yörünge sallayarak homojen bir boyutu olan toplamları üretmek için uygun bir roman var. Bu gemiler koşulları ve hücre içinde yığın üretim yüksek tekrarlanabilirlik denetlemek için önemli özelliğidir. Mümkün O şeklinde geminin yaygın uygulamadır. Rekombinant proteinler hücrelerden ve rejeneratif tıp için kök hücreleri ile uğraşırken üretirken kullanılabilir.
Sonuç olarak, biz bir roman O şeklinde çanta bir yörünge sallayarak kültürü ile tek tip hücre toplamları üretmek için uygun geliştirilmiştir. Çanta gibi çeşitli Biyomedikal uygulamaları için olanaklar içinde rejeneratif tıp gösterir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma FUKOKU, Co, Ltd Takao Yoshida FUKOKU, CO., Ltd. kültür O şeklinde çanta fikir sağlanan ile bir işbirliği tarafından desteklenmektedir. Takamasa Sato FUKOKU, Co, Ltd bu araştırma bir sayısal simülasyon açısından kültür O şeklinde çanta geliştirmek için desteklenen. Biz ilgili yazarın güncel eğilimleri, Osaka Üniversitesi, yayın üzerinde çalışmak için bize izin verdiği için takdir etmek istiyorum.
Materials
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear’s law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein’s tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
