Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von O-förmigen Schiffe, spezialisiert für Suspensionskulturen zellulären Aggregate mit orbital schütteln. Die HEK293 Zellen gewachsen in diese Tasche zu bilden mehr homogene Aggregate als die in herkömmlichen Kulturgefäße angebaut.
Abstract
Suspensionskulturen Säugerzelle Aggregate sind für verschiedene Anwendungen im medizinischen und biotechnologischen Bereich erforderlich. Die Einweg-Beutel-basierte Methode ist eine der einfachsten Techniken für die Massenproduktion von zellulären Aggregate, aber es schützt nicht die Kulturen gegen übermäßige Anhäufung, die auftritt, wenn sie in der unteren Mitte Kulturgefäß zu sammeln. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine O-förmige Schale und eine O-förmigen Tasche, von die keine zentrale Region enthält. Aggregate in beiden O-förmigen Kulturgefäß angebaut wurden deutlich gleichmäßiger Größe als Aggregate in konventionellen Schiffen gewachsen. Histologische Analysen zeigten, dass die Aggregate, die in herkömmlichen Kultur Gerichte enthalten nekrotische Kerne sehr wahrscheinlich verursacht durch eine schlechte Sauerstoffversorgung. Im Gegensatz dazu zeigte Aggregate, die in der O-förmigen Tasche, auch solche mit ähnlichen Durchmessern bis Aggregate in herkömmlichen Kultur Gerichte angebaut wurden nicht nekrotische Kerne. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die O-förmigen Tasche ausreichend Sauerstoff zu den Aggregaten durch die Sauerstoff-Durchlässigkeit des Materials Tasche bietet. Wir schlagen daher vor, dass diese neuartige gasdurchlässigen O-förmigen Kultur-Tasche für die Massenproduktion von einheitlicher Aggregate geeignet ist, die in verschiedenen biotechnologischen Felder notwendig sind.
Introduction
Zelle Suspensionskultur spielt eine wichtige Rolle in der Zellproduktion für regenerative Medizin1 und rekombinanter Protein Produktion2 , weil es einfach zu skalieren und zu erreichen hohen Zelldichten, manchmal bis zu mehr als 107 Zellen / mL-5. Chinesische Hamster Eierstock (CHO) Zellen3 und menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) sind vor kurzem in Kultur Federungssysteme für gewachsen und menschliche embryonale Nieren-Zellen 293 (HEK293)4 Suspensionskultur gewachsen worden regenerative Therapien,1,6,7. Die Verwendung von Suspensionskulturen wird voraussichtlich in der Zukunft erhöhen.
In Suspensionskultur einigen Zelllinien nicht als Einzelzellen wachsen und müssen daher Aggregate bilden. Zum Beispiel können hPSCs in Suspension Bedingungen nicht überleben ohne Aggregate zu bilden. Allerdings stellt diese Anforderung für aggregierte Wachstum Schwierigkeiten für homogene Suspensionskulturen. Eine Schwierigkeit ist die Bildung der einheitlichen Aggregate in der Frühzeit der Kultur, die die Effizienz der Aussetzung Kultur8bestimmt. Eine weitere Schwierigkeit ist der Stoffaustausch von Nährstoffen zu Aggregaten. Insbesondere die Versorgung mit Sauerstoff beschränkt die maximale Größe der Aggregate, und eine schlechte Sauerstoffversorgung bewirkt Nekrose in der Mitte der Aggregate9. Suspensionskulturen Zelle Aggregate sind daher schwieriger zu erreichen als herkömmliche Suspensionskulturen. Suspensionskulturen sind jedoch entscheidend für die Biomedizin und Biotechnologieanwendungen.
Orbital schütteln Schiffe sind eines der einfachsten Federungssysteme für Kultur, die Kulturmedium Mischungen ohne Laufrad Erregung zu erreichen. Scherspannung des Laufrades und der dynamischen Medium-Fluss ist das Hauptproblem der Suspensionskultur, weil es Zellschäden und Differenzierung verursacht. Um Agitation mit einer geringeren Scherbeanspruchung zu erreichen, entwickelten Forscher und Industrie eine Vielzahl von orbital schütteln Schiff Systeme2,10.
Konventionelle Kulturgefäße eignen sich jedoch nicht für Orbital schütteln Kulturen. In Orbital schütteln Schiffe Zellen angezogen die Mitte-unten der Gefäße durch eine Art von Medium-Fluss bekannt als die “Einsteins Tea leaf Paradox”11, wodurch die inhomogene Aggregation von Zellen. Die kreisförmige Strömung, verursacht durch eine Fliehkraft und eine Reibung zwischen dem Kulturmedium und ein Schiff fegt Zellen in der Mitte11,12. Darüber hinaus sind konventionelle Kultur Taschen für Massenkultur quadratische, die ist nicht geeignet für orbital schütteln.
In dieser Studie haben wir eine neue Kultur-Tasche geeignet für Orbital schütteln Kulturen entwickelt. Die Neuheit dieser Tasche ist die O-Form, die nicht über ein Zentrum-Gebiet, so dass Raffung an der unteren Mittelbereich Zellen verhindert werden. Wir haben auch den Umgang mit dieser Schiffe mit einer HEK293 Kultur zu zeigen, die Möglichkeit, diese Taschen für biotechnologische Anwendungen gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie entwickelt O-förmigen Schiffe und ein HEK293 Suspensionskultur in ihnen für einen einheitlichen Aggregate Bildung und Erweiterung durchgeführt. In der konventionellen Kulturschale produziert Orbital schütteln Kultur zwei unterschiedliche Durchmessern der Aggregate, während wir einheitliche Aggregate in den O-förmigen Gefäßen (Abbildung 1) beobachtet. Nach der Beobachtung der Verteilung von bunten Perlen in den orbitalen schütteln Bedingungen sammeln Perlen in der Mitte-unten von einer konventionellen Kulturschale. Diese Versammlung verursacht vermutlich die Dichteunterschiede Zelle führt zu verschiedenen Größen der Aggregate. Alternativ wurden Perlen in der O-förmige Schale verteilt, die nicht über die Mitte-unten-Region (ergänzende Abbildung1). Diese Verteilung verursacht wahrscheinlich die gleichmäßig große Aggregate in O-förmigen Schiffe. Eine weitere – weit verbreitete – Ansatz zur Herstellung einheitlicher Aggregate ist die Kultivierung in Mikrovertiefungen, aber dieser Ansatz hat einige Probleme, wie z. B. bei der Versorgung von einem Nährmedium ohne Aggregate der Ausstieg aus der Mikrovertiefungen13. Bei O-förmigen Schiffen können einheitliche Aggregate in einem einfachen Suspensionskultur hergestellt werden.
Die Orbital schütteln Kultur ist ein Popkultur-System für Säugerzellen eingesetzt. Es gibt verschiedene Kulturmethoden für die Massenproduktion von Säugerzellen, wie z. B. die Rührbehälters Bioreaktor14, Welle winkte Taschen15, und drehen der Flaschen. Orbitale schüttelnde Kulturen beinhalten keine innere Laufrad für das Rühren des Mediums, im Gegensatz zu den Rührbehälters Bioreaktor tut. Diese Funktion ist ähnlich wie die Welle winkte Taschen und rotierenden Flaschen. Diese Laufrad-freie Kultur-Systeme vermeiden Zellschädigung aus der Querkraft, die rund um die Laufräder und geringe Schubbeanspruchung in Suspensionskultur zu realisieren. Insbesondere sind orbital schütteln Kultur Systeme wegen ihrer hohen Skalierbarkeit und geringen Schubspannung effektiv für die Massenproduktion von lichtempfindlichen Zellen wie Säugetierzellen.
O-förmigen Schiffe können das verbleibende Problem der orbital schütteln Kultur in der Bildung von Aggregaten verbessern. Im Orbital schütteln Kultur-Systeme Wandern Einzelfeldern zum Zentrum und Boden des Gefässes, bekannt als die “Einsteins Tea leaf Paradox”11. Diese Migration verursacht die inhomogene Aggregation und ungleichmäßige aggregierte Produktion in konventionellen Orbital schütteln Schiffe. In dieser Studie verhindert O-förmigen Schiffe die Konzentration der Zellen in der Mitte unten der Gefäße, die zum Grund des einheitlichen Aggregation im orbital schütteln O-förmigen Schiffe spekuliert wird.
Histologische Analysen ergaben, dass die Aggregate in der konventionellen Schale denucleated Zellen (Abbildung 2a) enthalten. Im Gegensatz dazu erschien denucleated Zellen nicht in den Aggregaten aus O-förmigen Gefäßen (Abb. 2 b und 2 c). Es ist möglich, dass diese denucleated Zellen durch einen Mangel an Substraten wie Glukose, Glutamin und Sauerstoff9verursacht wurden. Entsprechend der Größenmessung hatte Aggregate in den Gefäßen O-förmigen homogene Durchmesser weniger als 400 µm. Im Gegensatz dazu in einem konventionellen Gericht einige Aggregate hatte einen Durchmesser größer als 400 µm, und diese Aggregate enthalten denucleated Zellen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Schaffung homogener Größe Aggregate in O-förmigen Schiffe wirksam bei der Kontrolle der Qualität der Aggregate. Darüber hinaus wird es auch spekuliert, dass die Sauerstoffversorgung durch die gasdurchlässigen Polyethylenfolie das Auftreten von denucleated Zellen in der O-förmigen Tasche verhindert.
Diese Experimente zeigten die Möglichkeit dieser O-förmigen Schiffe als ein einfaches System für die Herstellung einheitlicher Aggregate. Obwohl andere Kultur-Taschen für Suspensionskultur entwickelten15gewesen sein, sind diese Kultur Taschen Quadrat-geformte, die verhindert, dass der Kulturkreis effektiv in orbital schütteln gemischt. Die Tasche in dieser Studie hat einen Runde Form geeignet für orbital schütteln um Aggregate mit einer homogenen Größe produzieren Roman. Diese Eigenschaft der Schiffe ist wichtig für die Steuerung, die Bedingungen und die hohe Reproduzierbarkeit der Zellen in der Massenproduktion. Die mögliche Anwendung des O-förmigen Schiffes ist weit verbreitet. Es kann verwendet werden bei der Produktion von rekombinanten Proteinen aus Zellen und für die regenerative Medizin, beim Umgang mit Stammzellen.
Zusammenfassend haben wir einen Roman O-förmigen Tasche geeignet für die Herstellung von einheitlichen Zelle Aggregate mit einem orbital schütteln Kultur entwickelt. Die Tasche zeigt Möglichkeiten für verschiedene biomedizinische Anwendungen wie z. B. in der regenerativen Medizin.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird durch eine Zusammenarbeit mit Allgemeines, CO., Ltd. Takao Yoshida von Allgemeines, CO., Ltd. lieferte die Idee der O-förmigen Kultur Tasche unterstützt. Takamasa Sato von Allgemeines, CO., Ltd. unterstützt diese Forschung im Hinblick auf eine Computersimulation für die Entwicklung der O-förmigen Kultur-Tasche. Wir würden gerne aktuelle Zugehörigkeit des entsprechenden Autors, Osaka University, für die Erlaubnis zur Veröffentlichung arbeiten zu schätzen wissen.
Materials
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
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