Un Orbital agitación cultivo de células mamíferas en vasos en forma de O para producir agregados uniforme
Summary
Aquí presentamos un protocolo para el uso de vasos O formado, especializados para cultivos de suspensión de agregados celulares, con agitación orbital. Las células HEK293 crecidas en esta bolsa de forman más homogéneas agregados que los cultivados en recipientes de cultivo convencional.
Abstract
Culturas de la suspensión de los agregados de células de mamífero se requieren para diversas aplicaciones en los campos médicos y biotecnológicos. El método basado en la bolsa desechable es una de las técnicas más simples para la producción en masa de agregados celulares, pero no protege los cultivos contra la agregación excesiva, que ocurre cuando se reúnen en el centro inferior de la vasija de la cultura. Para resolver este problema, hemos desarrollado un plato en forma de O y un bolso en forma de O, ninguno de los cuales contiene una región central. Agregados en cualquier embarcación formada O de la cultura eran perceptiblemente más uniformes en tamaño que agregados en buques convencionales. Análisis histológicos demostrados que agregados en platos de cultivo convencionales contienen núcleos necróticos muy probablemente causadas por un suministro deficiente de oxígeno. Por el contrario, agregados que fueron cultivadas en la bolsa en forma de O, incluso aquellas con diámetros similares a los agregados en platos de cultivo convencionales, no presentaron núcleos necróticos. Estos resultados sugieren que la bolsa en forma de O proporciona suficiente oxígeno a los agregados debido a la permeabilidad al oxígeno del material de la bolsa. Por lo tanto, proponemos que este bolso de novela permeable al gas en forma de O cultura es conveniente para la producción en masa de agregados uniforme que son necesarias en distintos campos biotecnológicos.
Introduction
Cultivo de suspensión celular desempeña un papel importante en la producción de células para la medicina regenerativa1 y recombinante proteína producción2 porque es fácil de escalar y alcanzar densidades de célula alta, a veces hasta más de 107 células / mL5. 3 de células de ovario de hámster chino (CHO) y riñón embrionario humano células 293 (HEK293)4 se han cultivado en la cultura de la suspensión, y las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) recientemente se han cultivado en sistemas de cultivo de suspensión para regenerativa terapias1,6,7. El uso de las culturas de la suspensión se espera que aumente en el futuro.
En la cultura de suspensión, algunas líneas de células no pueden crecer como células individuales y por lo tanto, deben formar agregados. Por ejemplo, hPSCs no puede sobrevivir en las condiciones de la suspensión sin formar agregados. Sin embargo, este requisito para el crecimiento de agregados presenta dificultades para las culturas de la suspensión uniforme. Una dificultad es la formación de agregados uniforme en el período temprano de la cultura, que determina la eficacia de la suspensión la cultura8. Otra dificultad es la transferencia de masa de nutrientes en agregados. En particular, el suministro de oxígeno limita el tamaño máximo de agregados, y un suministro deficiente de oxígeno causa necrosis en el centro de agregados9. Por lo tanto, culturas de la suspensión de agregados de células son más difíciles de obtener que las culturas de la suspensión convencional. Sin embargo, las culturas de la suspensión son cruciales para biomédica y aplicaciones de la biotecnología.
Recipientes de agitación orbitales están uno de los más simples sistemas de cultivo de suspensión que lograr mezclas de medio de cultivo sin agitación impulsor. Tensión de esquileo de la hélice y el flujo medio dinámico es el principal problema de la cultura de suspensión porque causa daño celular y diferenciación. Para lograr la agitación con una menor tensión de esquileo, investigadores e industrias han desarrollado una variedad de agitación orbital buque sistemas2,10.
Sin embargo, los recipientes de cultivo convencionales no están diseñados para orbital sacudiendo las culturas. En orbital sacudiendo los vasos, las células gravitan hacia el centro inferior de los vasos por un tipo de flujo medio conocido como la “paradoja de la hoja del té de Einstein”11, que causa la agregación no homogénea de las células. El flujo circular, causado por una fuerza centrífuga y la fricción entre el medio de cultivo y un vaso, barre las células en el centro11,12. Además, bolsas de cultivo convencionales para la cultura de masas son en forma de cuadrado, que no es conveniente para agitación orbital.
En este estudio, hemos desarrollado una bolsa nueva cultura adecuada para orbital sacudiendo las culturas. La novedad de esta bolsa es su forma O que no tiene una región de centro, por lo que las células se impiden la reunión en la región de centro de la parte inferior. También hemos demostrado el manejo de estas embarcaciones con una cultura HEK293 para demostrar la posibilidad de estas bolsas para aplicaciones biotecnológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, desarrollaron naves en forma de O y realizar una cultura de suspensión HEK293 en ellos para una formación de agregados uniforme y expansión. En la placa de cultivo convencional, un orbital sacudiendo cultura produjo dos diversos diámetros de agregados, mientras que se observaron agregados uniforme en los vasos en forma de O (figura 1). Según la observación de la distribución de granos manchados en las condiciones de agitación orbitales, los granos se reúnen en el centro inferior de una placa de cultivo convencional. Esa reunión había causado probablemente la diferencia en la densidad celular a diferentes tamaños de agregados. Alternativamente, los granos fueron distribuidos en el plato en forma de O que no tiene la región centro-inferior (suplementario Figura 1). Probablemente esta distribución hace que los agregados de tamaño uniforme en vasos en forma de O. Otro — ampliamente utilizado: enfoque a la producción de agregados uniforme es el cultivo en los micropocillos, pero este enfoque tiene algunos problemas, como en el suministro de un medio de cultivo sin agregados que cae fuera de los micropocillos13. En el caso de los recipientes en forma de O, se pueden producir agregados uniforme en una cultura de suspensión simple.
El orbital sacudiendo la cultura es un sistema de cultura popular utilizado para células de mamífero. Hay varios métodos de cultivo para la producción masiva de células de mamíferos, como el depósito de agitación biorreactor14, bolsas movió la onda15y botellas. Culturas de agitación orbitales no incluyen un rotor interno para agitar el medio, a diferencia del de tanque agitado hace un biorreactor. Esta función es similar a la onda movió bolsas y botellas giratorios. Estos sistemas de cultivo libre de impulsor pueden evitar el daño celular de la fuerza de esquileo que rodean los impulsores y realizar bajo tensión de esquileo en la cultura de la suspensión. Sobre todo, sistemas de cultivo agitación orbital son eficaces para la producción masiva de células sensibles tales como células de mamíferos debido a su alta escalabilidad y bajo tensión de esquileo.
Los vasos en forma de O pueden mejorar el problema que queda de la cultura agitación orbital en la formación de agregados. En orbital sacudiendo los sistemas de cultivo, las células flotantes emigran al centro y fondo del recipiente, que se conoce como la “paradoja de la hoja del té de Einstein”11. Esta migración provoca la agregación no homogénea y la producción agregada no uniforme en orbital convencional sacudiendo los vasos. En este estudio, los vasos en forma de O evitar la concentración de células en el centro de fondo de los vasos, que se especula como la razón de uniforme agregación en vasos de forma O agitación orbitales.
Análisis histológicos demostraron que los agregados en el plato convencional contuvieron las células denucleated (Figura 2a). En contraste, las células denucleated no aparece en los agregados de los recipientes en forma de O (figura 2b y 2C). Es posible que estas células denucleated fueron causadas por la escasez de sustratos como la glucosa, glutamina y oxígeno9. Según la medición del tamaño, agregados en los vasos en forma de O tenían homogéneos diámetros inferiores a 400 μm. En cambio, en una fuente convencional, algunos agregados tenían un diámetro superior a 400 μm, y estos agregados incluyen las células denucleated. Este resultado sugiere que la creación de agregados de tamaño homogéneo en vasos en forma de O es eficaz en el control de la calidad de los agregados. Además, también se especula que la oxigenación a través de la película de polietileno gas-permeables prevenir la aparición de células denucleated en la bolsa en forma de O.
Estos experimentos demostraron la posibilidad de estos vasos en forma de O como un sistema simple para la producción de agregados uniforme. Aunque otros bolsos de la cultura para la cultura de la suspensión se han desarrollado15, esas bolsas de cultura son en forma de cuadrado, lo que impide la cultura efectivamente conseguir mezcla en agitación orbital. La bolsa en este estudio tiene una novela redonda de forma conveniente para agitación orbital para producir agregados con un tamaño homogéneo. Esta característica de los vasos es importante para el control de las condiciones y la alta reproducibilidad de células de producción en masa. La posible aplicación de la nave en forma de O es generalizada. Puede ser utilizado al producir proteínas recombinantes de las células y para la medicina regenerativa con células madre.
En conclusión, hemos desarrollado una novela en forma de O bolsa adecuada para la producción de agregados de células uniformes con una cultura de agitación orbital. La bolsa de muestra posibilidades para diversas aplicaciones biomédicas tales como en medicina regenerativa.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por una colaboración con Yoshida de Takao KYŌHEI, CO., Ltd. de KYŌHEI, CO., Ltd. proporciona la idea de la bolsa formada O de la cultura. Takamasa Sato de KYŌHEI, CO., Ltd. apoyó esta investigación en términos de una simulación computacional para el desarrollo de la bolsa formada O de la cultura. Nos gustaría apreciar afiliación actual del autor correspondiente, la Universidad de Osaka, para lo que nos permite trabajar en la publicación.
Materials
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
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