Um Orbital agitando a cultura de células de mamíferos em vasos em forma do produzir agregados uniformes
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para a utilização dos recipientes em forma de O, especializados para culturas de suspensão de agregados celulares, com agitação orbital. As células HEK293 crescidas neste saco mais formam agregados homogêneos do que aquelas cultivadas em vasos de cultura convencional.
Abstract
Culturas de suspensão de agregados de células de mamíferos são necessárias para diversas aplicações nas áreas médicas e biotecnológicas. O método baseado em saco descartável é uma das técnicas mais simples para a produção em massa dos agregados celulares, mas ele não protege as culturas contra excesso de agregação, que ocorre quando eles se juntam na parte inferior central da embarcação cultura. Para resolver este problema, desenvolvemos um forma de O prato e um saco em forma de O, nenhum dos quais contém uma região central. Agregados, cultivados em vaso de qualquer cultura em forma de O estavam visivelmente mais uniformes no tamanho do que agregados cultivados em vasos convencionais. Análise histológica mostrou que agrega em pratos de cultura convencional contido necróticos núcleos provavelmente causados por uma alimentação pobre de oxigênio. Em contraste, agregados que foram cultivados no saco em forma de O, mesmo aqueles com diâmetros semelhantes e agregados em pratos de cultura convencional, não mostrou núcleos necróticos. Estes resultados sugerem que a forma de O saco fornece oxigênio suficiente para os agregados devido a permeabilidade do oxigênio do material saco. Portanto, propomos que este saco de romance permeável ao gás em forma de O cultura é apropriado para a produção em massa dos agregados uniformes que são necessários em várias áreas biotecnológicas.
Introduction
Cultura de células de suspensão desempenha um papel importante na produção celular para medicina regenerativa1 e recombinante da proteína de produção2 porque é fácil de crescer e atingir célula de alta densidade, às vezes até mais de 107 células / mL5. 3 células de ovário de hamster chinês (CHO) e células renais embrionárias humanas 293 (HEK293)4 ter sido crescidas na cultura de suspensão, e células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) recentemente têm sido cultivadas em sistemas de cultura de suspensão para regenerativa terapias de6,1,7. O uso de culturas de suspensão deverá aumentar no futuro.
Na cultura de suspensão, algumas linhas de célula não crescem como células únicas e devem, portanto, formar agregados. Por exemplo, hPSCs não pode sobreviver em condições de suspensão sem formar agregados. No entanto, este requisito para o crescimento agregado apresenta dificuldades para culturas de suspensão uniforme. Uma dificuldade é a formação de agregados de uniformes no início do período da cultura, que determina a eficiência da suspensão cultura8. Outra dificuldade é a transferência de massa de nutrientes em agregados. Em particular, o suprimento de oxigênio limita o tamanho máximo dos agregados, e um suprimento de oxigênio pobre causa necrose no centro de agregados9. Consequentemente, as culturas de suspensão de agregados de células são mais difíceis de obter do que as culturas convencionais de suspensão. No entanto, culturas de suspensão são cruciais para biomédicos e aplicações da biotecnologia.
Vasos de agitação orbitais são um dos sistemas mais simples de cultura suspensão que realizar misturas de meio de cultura sem a agitação do impulsor. Tensão de cisalhamento do rotor e o fluxo médio dinâmico é o grande problema da cultura de suspensão porque provoca danos de célula e diferenciação. Para atingir a agitação com uma baixa tensão de cisalhamento, indústrias e pesquisadores desenvolveram uma variedade de nave orbital tremendo sistemas2,10.
No entanto, os navios convencionais de cultura não são projetados para orbital culturas a tremer. No orbital tremendo vasos, células gravitam centro-fundo dos vasos por um tipo de fluxo médio conhecido como o “paradoxo de folha de chá de Einstein”11, que faz com que a agregação não homogênea de células. O fluxo circular, causado por uma força centrífuga e uma fricção entre o meio de cultura e um navio, varre as células para o centro de11,12. Além disso, sacos convencionais de cultura para cultura de massa são em forma de quadrado, que não é adequado para agitação orbital.
Neste estudo, nós desenvolvemos um saco de romance de cultura apropriado para orbital culturas a tremer. A novidade deste saco é sua forma-O que não tem uma região do centro, para que as células sejam impedidas de reunião na região inferior do centro. Também demonstrámos a manipulação desses vasos com uma cultura HEK293 para demonstrar a possibilidade destes sacos para aplicações biotecnológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, nós desenvolvemos O em forma de vasos e realizada uma cultura de suspensão HEK293 neles para uma formação de agregados de uniforme e expansão. A placa de cultura convencional, um orbital tremendo cultura produziu dois diâmetros diferentes de agregados, Considerando que observamos agregados uniformes nos vasos em forma de O (Figura 1). De acordo com a observação da distribuição dos grânulos corados nas condições de agitação orbitais, grânulos reúnem-se em baixo o centro de um prato de cultura convencional. Esse encontro presumivelmente causado a diferença na densidade celular, levando a vários tamanhos de agregados. Alternativamente, grânulos foram distribuídos no prato em forma de O que não tem a região centro-inferior (Supplemental Figura 1). Esta distribuição provavelmente faz com que os agregados de tamanho uniformemente em vasos em forma de O. Outro — amplamente utilizado — abordagem para produzir agregados uniformes é o cultivo em poços da microplaca, mas esta abordagem tem alguns problemas, tais como em fornecer um meio de cultura sem agregados caindo fora os micropoços13. No caso de O em forma de vasos, agregados uniformes podem ser produzidos em uma cultura de suspensão simples.
A orbital agitando a cultura é um sistema de cultura popular utilizado para células de mamíferos. Existem vários métodos de cultura para a produção em massa de células de mamíferos, tais como o tanque mexido biorreator14, onda-acenou sacos15e garrafas de giro. Culturas de agitação orbitais não incluem um rotor interno para agitar o meio, ao contrário do tanque mexido biorreator não. Esta funcionalidade é semelhante à onda-acenou sacos e garrafas rotativas. Estes sistemas de cultura livre de rotor podem evitar danos celulares da força de cisalhamento em torno os impulsores e perceber a baixa tensão de cisalhamento na cultura de suspensão. Especialmente, agitação orbital sistemas de cultura são eficazes para a produção em massa de células sensíveis, tais como células de mamíferos devido à sua alta escalabilidade e baixa tensão de cisalhamento.
O em forma de vasos podem melhorar o problema remanescente da cultura de agitação orbital na formação de agregados. No orbital sistemas de cultura a tremer, flutuantes células migram para o centro e o fundo do navio, que é conhecido como o “paradoxo de folha de chá de Einstein”11. Esta migração faz com que a agregação não homogênea e não-uniforme produção agregada em orbital convencional tremer os navios. Neste estudo, vasos em forma de O evitar a concentração de células no centro-fundo dos vasos, que especula-se como a razão de agregação uniforme em orbital agitando O em forma de vasos.
Análise histológica mostrou que os agregados no prato convencional denucleated células (Figura 2a). Em contraste, as células denucleated não apareceu nos agregados de vasos em forma de O (Figura 2b e 2C). É possível que estas células denucleated foram causadas por uma escassez de substratos tais como glicose, glutamina e oxigênio9. De acordo com a medição do tamanho, agregados nos vasos em forma de O tinham homogêneos diâmetros inferiores a 400 µm. Em contraste, em um prato convencional, alguns agregados tinham um diâmetro superior a 400 µm, e estes agregados incluíam denucleated células. Este resultado sugere que a criação de agregados de tamanho homogêneo em vasos em forma de O é eficaz no controle de qualidade dos agregados. Além disso, também é especulado que a oxigenação através do filme de polietileno gás-permeável impedido o aparecimento de células denucleated no saco em forma de O.
Estes experimentos mostraram a possibilidade destes vasos em forma de O como um sistema simples para a produção de agregados de uniformes. Embora outros sacos de cultura para cultura de suspensão foram desenvolvidos15, os sacos de cultura são em forma de quadrado, que impede que a cultura de meter-se efetivamente em agitação orbital. O saco neste estudo tem um romance ronda forma apropriada para agitação orbital para produzir agregados com um tamanho homogêneo. Essa característica dos vasos é importante para controlar as condições e a grande reprodutibilidade das células na produção em massa. A possível aplicação da embarcação em forma de O é generalizada. Ele pode ser usado quando a produção de proteínas recombinantes de células e para a medicina regenerativa ao lidar com células-tronco.
Em conclusão, nós desenvolvemos um romance em forma de O saco apropriado para a produção de agregados de células uniforme com uma cultura de agitação orbital. A bolsa mostra possibilidades para várias aplicações biomédicas, tais como na medicina regenerativa.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é suportada por uma colaboração com o FUKOKU, CO., Ltd. Takao Yoshida de FUKOKU, CO., Ltd. forneceu a ideia do saco O em forma de cultura. Takamasa Sato de FUKOKU, CO., Ltd. suporte esta pesquisa em termos de uma simulação computacional para o desenvolvimento do saco O em forma de cultura. Gostamos de apreciar a afiliação atual do autor correspondente, a Universidade de Osaka, por permitir-na trabalhar na publicação.
Materials
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear’s law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein’s tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
