Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene
Summary
ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell’induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all’età.
Abstract
La senescenza cellulare è stata considerata uno stato di arresto di crescita irreversibile salvo esaurimento della capacità proliferativa o l’esposizione a varie sollecitazioni. Studi recenti hanno esteso il ruolo della senescenza cellulare ai vari processi fisiologici, tra cui lo sviluppo, la guarigione della ferita, sorveglianza immune e disfunzione del tessuto senile. Anche se l’arresto del ciclo cellulare è una caratteristica fondamentale della senescenza cellulare, una produzione di ossigeno reattivo intracellulare aumentato specie (ROS) è stata dimostrata anche a giocare un ruolo importante nell’induzione della senescenza cellulare. Inoltre, studi recenti hanno rivelato che le cellule senescenti esibiscono le attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP). Il forte aumento di interesse per quanto riguarda le strategie terapeutiche contro la senescenza cellulare dà risalto all’esigenza di una precisa comprensione dei meccanismi di senescenza, compreso ROS intracellulari e la SASP. Qui, descriviamo protocolli per valutare quantitativamente i livelli intracellulari di ROS durante la senescenza cellulare indotta da H-Ras usando la tintura fluorescente ROS sensibile e citometria a flusso. Inoltre, vi presentiamo le tecniche sensibili per l’analisi dell’induzione dell’espressione del mRNA e la secrezione di fattori SASP. Questi protocolli possono essere applicati a vari modelli di senescenza cellulare.
Introduction
Più di 50 anni fa, Hayflick e Moorhead ha rivelato che le cellule normali immettere arresto di crescita irreversibile salvo l’esaurimento della loro potenziale proliferativo dopo un certo numero di divisioni cellulari1. Questo fenomeno è ora conosciuto come senescenza replicativa e si crede per correlare fortemente con invecchiamento organismal2. Anche se la progressiva erosione dei telomeri è considerata delle principali cause di senescenza replicativa, vari sforzi cellulari, come il danno del DNA, l’attivazione oncogenica e stress ossidativo, sono stati segnalati per indurre un altro tipo di senescenza cellulare chiamato “la senescenza prematura” o “stress-indotta senescenza”. Interessante, la senescenza prematura svolge un ruolo di tumore-soppressiva potente al momento dell’attivazione di oncogeni come H-Ras e BRAF. Studi di modelli murini e tessuti umani hanno prodotto la prova ben fondata che biomarcatori di senescenza cellulare erano principalmente presenti nelle lesioni premaligne dove oncogeni Ras e BRAF sono attivati ma sono stati diminuiti nei tumori maligni che si è sviluppato da Queste lesioni3,4,5. Oltre il suo ruolo nell’invecchiamento e nella soppressione del tumore, senescenza cellulare ha dimostrata in studi precedenti di svolgere un ruolo in vari processi fisiologici, tra cui la guarigione della ferita, riparazione dei tessuti, sorveglianza immune e sviluppo embrionale6.
Anche se l’arresto di crescita è stato ampiamente studiato come un segno distintivo della senescenza cellulare7, un corpo significativo di prova suggerisce che le specie reattive intracellulari dell’ossigeno (ROS) contribuiscono anche alla senescenza cellulare8. L’elevazione dei livelli di ROS durante vari tipi di senescenza cellulare, tra cui senescenza replicativa e senescenza indotta da oncogene (OIS), è stato segnalato originariamente decenni fa9,10. Più direttamente, il trattamento esogeno con una dose subletale di H2O2 induce senescenza11,12. L’inibizione di enzimi di ROS-lavaggio, come SOD1, causa anche la senescenza prematura13. Al contrario, basse condizioni di ossigeno ambientale e aumentando il ritardo ROS scavenging l’insorgenza della senescenza10,14,15. Questi risultati indicano senza dubbio che i ROS sono mediatori importanti o determinanti dell’induzione della senescenza cellulare. Tuttavia, come ROS contribuiscono all’induzione della senescenza cellulare e come i livelli di ROS sono elevati durante la senescenza cellulare richiedono ulteriori indagini.
Recenti studi hanno rivelato che le cellule senescenti hanno attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un’ SASP16,17. In tessuto invecchiato, cellule senescenti promuovono tessuto senile disfunzioni attraverso molte vie attraverso SASP oltre uno svuotamento autonoma di cellule proliferative. Vari fattori proinflammatory, quali IL-6, IL-8, TGFβ e metalloproteinasi di matrice (MMP), secernute dalle cellule senescenti, causano disfunzioni relative all’età del tessuto attraverso la compromissione dell’omeostasi tissutale, distruzione dell’architettura del tessuto, senescenza delle cellule vicine e infiammazione sterile18,19. Tuttavia, SASPs può avere effetti benefici a seconda del contesto biologico. Inoltre, la natura di heterogenetic di SASPs dipende il tipo delle cellule senescenti e la fase delle cellule, dante risalto all’esigenza di ulteriore ricerca19.
Qui, descriviamo le tecniche basate su cytometry veloce e sensibile per la valutazione dei livelli intracellulari di ROS durante OIS. Inoltre, vengono presentati i metodi per l’analisi dei fattori SASP usando reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) ed ELISA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo presentato metodi per il monitoraggio dei livelli intracellulari di ROS durante H-Ras-indotta senescenza in fibroblasti umani normali WI-38. I livelli intracellulari di ROS in cellule vive, che possono essere misurati quantitativamente utilizzando il reagente cellula-permeabile DCF-DA e citometria a flusso. Al momento l’assorbimento cellulare, DCF-DA è viene desacetilato agli acidi dalle esterasi intracellulari e, successivamente, ossidato dai ROS per formare altamente fluorescente 2′, 7′-diclorofluorescina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) e da una sovvenzione del National Research Foundation di Corea (NRF) finanziata dal governo di Corea (MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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