قياس كمي للأنواع الأكسجين التفاعلية والنمط الظاهري الافرازية المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية العادية أثناء الشيخوخة التي يسببها السرطاني
Summary
لقد ثبت روس داخل الخلايا تلعب دوراً هاما في تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة الخلوية. هنا، يمكننا وصف مقايسة حساسة لقياس مستويات روس أثناء الشيخوخة الخلوية. نحن نقدم أيضا بروتوكولات لتقييم المرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري، الذي يقال أن تساهم مختلف الاختلالات المرتبطة بالسن.
Abstract
الشيخوخة الخلوية اعتبرت حالة من النمو الذي لا رجعة فيه القبض عند استنفاد القدرات التكاثري أو التعرض للضغوط المختلفة. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد مددت دور الشيخوخة الخلوية لمختلف العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك التنمية والتئام والترصد المناعي والخلل في الأنسجة المرتبطة بالسن. على الرغم من دورة الخلية اعتقال سمة مميزة حرجة للشيخوخة الخلوية، أثبتت أيضا إنتاج أنواع (روس) زيادة أكسجين تفاعلية داخل الخلايا تلعب دوراً هاما في تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت الدراسات الحديثة أن خلايا مسن يحمل الأنشطة paracrine قوية على الخلايا والأنسجة من خلال المرتبطة بالشيخوخة افرازية النمط الظاهري (ساسب) المجاورة. الزيادة الحادة في المصالح فيما يتعلق باستراتيجيات علاجية ضد الشيخوخة الخلوية تشدد على الحاجة إلى فهم دقيق لآليات الشيخوخة، بما في ذلك روس داخل الخلايا وساسب. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات لتقييم كمي داخل الخلايا روس المستويات أثناء الشيخوخة الخلوية التي يسببها رأس ح استخدام صبغة الفلورسنت المراعية لروس والتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم التقنيات الحساسة لتحليل إدخال التعبير مرناً وإفراز عوامل ساسب. يمكن تطبيق هذه البروتوكولات إلى النماذج الشيخوخة الخلوية المختلفة.
Introduction
أكثر من 50 عاماً، هايفليك ومورهيد كشفت أن الخلايا الطبيعية أدخل النمو لا رجعة فيه القبض عند استنفاد إمكاناتها التكاثري بعد عدد معين من الانقسامات الخلية1. يعرف الآن باسم الشيخوخة ريبليكاتيفي هذه الظاهرة ويعتقد ترتبط بشدة بالشيخوخة العضوي2. على الرغم من التدهور التدريجي التيلومير يعتبر سببا رئيسيا للشيخوخة replicative، تؤكد الخلوية المختلفة، مثل تلف الحمض النووي والتنشيط النمطان والأكسدة، قد أبلغت إلى الحث على نوع آخر من الشيخوخة الخلوية ودعا “الشيخوخة المبكرة” أو “الشيخوخة الناجمة عن الإجهاد”. من المثير للاهتمام، الشيخوخة المبكرة يلعب دوراً ورم قمعية قوية عند تفعيل المسرطنة مثل رأس ح وبراف. دراسات نماذج الماوس والأنسجة البشرية قد أنتجت أدلة قوية على أن المؤشرات الحيوية للخلية الشيخوخة كانت موجودة أساسا في الآفات بريماليجنانت حيث يتم تنشيط النمطان Ras وبراف لكن تتضاءل في الأمراض السرطانية الخبيثة التي وضعت من هذه الآفات3،،من45. تتجاوز دورها في الشيخوخة وقمع الورم، أظهرت الشيخوخة الخلوية في دراسات سابقة أن تلعب دوراً في العمليات الفسيولوجية المختلفة، بما في ذلك التئام وإصلاح الأنسجة، ومراقبة محصنة والتنمية الجنينية6.
على الرغم من أن تم القبض على النمو درست على نطاق واسع كسمة مميزة للشيخوخة الخلوية7، تقترح مجموعة كبيرة من الأدلة أن الأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (روس) يسهم أيضا في الشيخوخة الخلوية8. الارتقاء بمستويات روس خلال مختلف أنواع الشيخوخة الخلوية، بما في ذلك الشيخوخة ريبليكاتيفي والشيخوخة التي يسببها السرطاني (منظمة المؤتمر الإسلامي)، وذكر أصلاً قبل عقود9،10. أكثر مباشرة، يدفع المعاملة الخارجية مع جرعة المقاسة من ح2س2 الشيخوخة11،12. كما يسبب تثبيط الإنزيمات الكسح روس، مثل SOD1، الشيخوخة المبكرة13. في المقابل، تدني الظروف المحيطة الأكسجين وزيادة روس الكسح تأخير ظهور الشيخوخة10،،من1415. لا شك في أن تشير هذه النتائج إلى أن روس هي مهمة الوسطاء أو محددات تعريفية الشيخوخة الخلوية. ومع ذلك، كيف روس يسهم في استحثاث الشيخوخة الخلوية وكيف روس مستويات مرتفعة خلال الشيخوخة الخلوية تتطلب مزيدا من التحقيق.
وأظهرت الدراسات الأخيرة أن مسن الخلايا ذات الأنشطة paracrine قوية على الخلايا والأنسجة من خلال16،ساسب17المجاورة. في الأنسجة، والذين تتراوح أعمارهم بين تعزيز مسن خلايا الأنسجة المرتبطة بالسن الاختلالات الوظيفية عن طريق مسارات كثيرة من خلال ساسب علاوة استنفاد الخلايا التكاثري المتمتعة بالحكم الذاتي. Proinflammatory عوامل مختلفة، مثل إيل-6، إيل-8, TGFβ، ومصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى)، يفرز من خلايا مسن، تتسبب في اختلال الأنسجة المرتبطة بالسن من خلال الأضرار بالتوازن الأنسجة، تدمير الهيكل، والأنسجة الشيخوخة من الخلايا المجاورة، والتهاب العقيمة18،19. ومع ذلك، وفقا يمكن آثار مفيدة تبعاً لسياق البيولوجية. وباﻹضافة إلى ذلك، طبيعة وفقا هيتيروجينيتيك يعتمد على نوع خلية مسن ومرحلة الخلية، وإذ تشدد على الحاجة إلى مزيد من البحوث19.
هنا، يمكننا وصف الأساليب المستندة إلى الخلوي السريع والحساسة لتقييم مستويات روس داخل الخلايا أثناء أبحر. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض أساليب لتحليل العوامل ساسب استخدام الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) وإليزا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وقد قدمنا أساليب لرصد مستويات روس داخل الخلايا أثناء الشيخوخة التي يسببها رأس ح في أي-38 الليفية البشرية العادية. يمكن أن تقاس كمياً باستخدام الكاشف نفاذية الخلية المخصوم دا مستويات روس داخل الخلايا في الخلايا الحية والتدفق الخلوي. عند الإقبال على الهاتف الخلوي، منتدى التعاون الإنما?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه من “مؤسسة البحوث الوطنية كوريا” (2015R1D1A1A01060839) (إلى كيم يون يونغ) ومنحة وطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله حكومة كوريا (مست) (لا 2016R1A2B2008887، رقم 2016R1A5A2007009) (أن يحرر جينو).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
- Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
- Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
- Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
- Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
- Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
- Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
- Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
- Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
- Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
