Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında
Summary
Hücre içi ROS hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında miktarının için hassas bir tahlil açıklayın. Ayrıca bildirildi çeşitli yaş ile ilgili işlev bozuklukları için katkıda yaşlanma ilişkili salgı fenotip, değerlendirmek için protokolleri sağlar.
Abstract
Hücresel yaşlanma geri dönüşü olmayan büyüme tutuklama üzerine proliferatif kapasitesi veya çeşitli gerilmeler maruz bitkinlik hali olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda hücresel yaşlanma geliştirme, yara iyileşmesi, immün gözetim ve yaşa bağlı doku disfonksiyon da dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçleri için rol genişletmiştir. Hücre döngüsü tutuklama hücresel yaşlanma kritik damgasını olsa da, bir artan hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretim de hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynamaya gösterdi. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda senescent hücreler komşu hücre ve dokuların bir yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP) aracılığıyla güçlü parakrin faaliyetleri sergi ortaya koydu. Hücresel yaşlanma karşı tedavi stratejileri ile ilgili faiz keskin artış yaşlanma mekanizmaları, hücre içi ROS ve SASP de dahil olmak üzere tam bir anlayış ihtiyacını vurgular. Burada, kantitatif ROS duyarlı floresan boya ve akış sitometresi kullanarak H-Ras-indüklenen hücresel yaşlanma sırasında hücre içi ROS düzeylerini değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar. Buna ek olarak, biz mRNA ifade indüksiyon ve salgı SASP faktör analizi için hassas teknikleri tanıtmak. Bu protokoller çeşitli hücresel yaşlanma modelleri için uygulanabilir.
Introduction
Daha 50 yıl önce ortaya Hayflick ve Moorhead normal hücreleri geri dönüşü olmayan büyüme tutuklama proliferatif potansiyellerini tükenme hücre bölümler1belirli sayıda sonra üzerine girin. Bu olay şimdi ikileştirici yaşlanma bilinen ve güçlü organizmalar yaşlanma2ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir inanılıyor. Ne kadar telomerlerin ilerici erozyon ikileştirici yaşlanma önemli bir nedeni olarak, DNA hasarı, oncogenic harekete geçirmek ve oksidatif stres, gibi çeşitli hücresel vurguluyor başka tür bir hücresel yaşlanma ikna etmek için bildirilmiştir “erken yaşlanma” veya “stres kaynaklı yaşlanma” denir. İlginçtir, erken yaşlanma oncogenes H-Ras ve BRAF gibi etkinleştirme üzerine güçlü bir tümör baskılayıcı rol oynar. Fare modelleri ve insan doku biyolojik hücre yaşlanma ağırlıklı olarak nerede oncogenic Ras ve BRAF aktif hale gelir ama dayandığı malign kanserleri azaldı premalign lezyonlar içinde yoktu güçlü kanıtlar doğurmuştur Bu lezyonlar3,4,5. Yaşlanma ve tümör bastırma rolü, hücresel yaşlanma, yara iyileşmesi, doku onarımı, immün gözetim ve embriyonik gelişim6dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerinde bir rol oynamaya önceki çalışmalarda gösterilmiştir.
Her ne kadar büyüme tutuklama yaygın hücresel yaşlanma7damgasını okudu, kanıt önemli bir vücut o hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) da hücresel yaşlanma8‘ e katkıda bulunur göstermektedir. ROS düzeyleri yükseltme sırasında çeşitli tip-in hücresel yaşlanma ikileştirici yaşlanma ve onkogen kaynaklı yaşlanma (OIS), dahil olmak üzere, on yıl önce ilk olarak bildirildi9,10. Bir daha doğrudan, yaşlanma11,12H2O2 sublethal bir doz ile eksojen tedavi neden olmaktadır. SOD1 gibi ROS atma enzim inhibisyonu da erken yaşlanma13neden olur. Buna ek olarak, düşük ortam oksijen koşulları ve artan ROS atma gecikme yaşlanma10,14,15başlangıcı. Bu sonuçlar kuşkusuz ROS önemli arabulucu veya hücresel yaşlanma indüksiyon belirleyicileri olduğunu gösteriyor. Hücresel yaşlanma ve nasıl ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında yüksek indüksiyon ROS katkıda nasıl ancak, daha fazla araştırma gereken.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda senescent hücreler komşu hücrelere ve dokulara den bir SASP16,17güçlü parakrin faaliyetleri var ortaya çıkardı. Yaşlı dokusunda senescent hücreleri SASP aracılığıyla birçok yolları özerk bir tükenmesi proliferatif hücrelerinin yanı sıra yaşa bağlı doku işlev bozuklukları ile tanıtmak. Çeşitli proinflamatuar faktörler, IL-6 gibi yaşa bağlı doku bozuklukları doku homeostazı, imha doku mimarisinin bozulma ile Il-8, TGFβ ve senescent hücreleri tarafından salgılanan matriks metalloproteinazların (MMPs), neden yaşlanma komşu hücrelerin ve steril iltihap18,19. Ancak, SASPs biyolojik bağlamda bağlı olarak yararlı etkileri olabilir. Buna ek olarak, senescent hücre türü ve daha fazla araştırma19ihtiyacını vurgulayan hücre sahne SASPs heterogenetic doğası bağlıdır.
Burada, hücre içi ROS düzeyleri OIS sırasında değerlendirmek için hızlı ve hassas sitometresi tabanlı teknikleri açıklar. Buna ek olarak, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve ELISA kullanarak SASP faktör analizi için yöntemler tanıtılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, H-Ras-indüklenen yaşlanma WI-38 normal insan fibroblast içinde sırasında hücre içi ROS düzeyleri izlemek için yöntem sunulmuştur. Canlı hücrelerde hücre içi ROS düzeyleri kantitatif hücre geçirgen reaktif DCF-DA kullanarak ölçülen ve akış sitometresi. Hücresel alımı DCF-DA hücre içi esterazlar tarafından deacetylated ve daha sonra son derece floresan 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCF) oluşturmak üzere ROS tarafından okside. DCF floresan bir FL1 dedektörü (yeşil floresan) kullanara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (2015R1D1A1A01060839) bir hibe (için Young Yeon Kim) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen bir Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) hibe tarafından desteklenmiştir (Hayır 2016R1A2B2008887 No 2016R1A5A2007009) (için Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
- Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
- Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
- Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
- Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
- Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
- Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
- Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
- Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
- Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
