Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz
Summary
Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.
Abstract
Zelluläre Seneszenz wurde einen Zustand der irreversiblen Wachstum Festnahme nach Erschöpfung der proliferative Kapazität oder Exposition gegenüber verschiedenen Belastungen berücksichtigt. Jüngste Studien haben die Rolle der zellulären Seneszenz, verschiedene physiologische Prozesse, einschließlich Entwicklung, Wundheilung, immunüberwachung und altersbedingte Gewebe Dysfunktion erweitert. Zwar Zellzyklus Festnahme einer kritischen Markenzeichen der zellulären Seneszenz, wurde eine erhöhte intrazelluläre reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Produktion auch eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz gezeigt. Neue Studien zufolge darüber hinaus seneszenten Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) ausstellen. Die starke gestiegene Interesse bezüglich Therapiestrategien gegen zelluläre Seneszenz betont die Notwendigkeit für ein genaues Verständnis der Seneszenz Mechanismen, einschließlich der intrazellulären ROS und der SASP. Hier beschreiben wir Protokolle für die Beurteilung der quantitativ intrazelluläre ROS Ebenen während H-Ras-induzierte zellulären Seneszenz mit ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und Durchflusszytometrie. Darüber hinaus stellen wir sensible Techniken für die Analyse der Induktion von mRNA Expression und Sekretion von SASP Faktoren. Diese Protokolle können auf verschiedenen zellulären Seneszenz Modelle angewendet werden.
Introduction
Mehr als 50 Jahren offenbarte Hayflick und Moorhead, dass normale Zellen irreversibel Wachstum Verhaftung auf die Erschöpfung der proliferativen entfalten nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen1eingeben. Dieses Phänomen ist heute bekannt als replikative Seneszenz und wird geglaubt, um mit organismal Altern2stark korrelieren. Obwohl die fortschreitende Erosion der Telomere als eine der Hauptursachen für replikative Seneszenz gilt, worden verschiedenen zelluläre Belastungen, wie DNA-Schäden, Onkogene Aktivierung und oxidativen Stress, berichtet, eine andere Art der zellulären Seneszenz induzieren “vorzeitige Seneszenz” oder “Stress-induzierte Seneszenz” genannt. Interessanterweise spielt vorzeitige Seneszenz eine potente Tumor-suppressive Rolle bei der Aktivierung der Onkogene wie H-Ras und BRAF. Studien an Mäusen und menschlichen Geweben haben starke Beweise hergestellt, die Biomarker der Zelle Seneszenz überwiegend in prämaligne Läsionen vorhanden waren, wo Onkogenen Ras und BRAF sind aktiviert, aber wurden in bösartigen Tumoren, die von entwickelt vermindert Diese Läsionen3,4,5. Über seine Rolle als Altern und Tumor-Unterdrückung zelluläre Seneszenz in früheren Studien nachweislich eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der Wundheilung, Gewebereparatur immunüberwachung und embryonale Entwicklung6.
Obwohl Wachstum Verhaftung als ein Markenzeichen der zellulären Seneszenz7ausgiebig untersucht wurde, schlägt eine erhebliche Zahl von beweisen, dass die intrazelluläre reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auch einen Beitrag zur zellulären Seneszenz8. Die Höhe des ROS Ebenen während der verschiedenen Arten der zellulären Seneszenz, einschließlich replikative Seneszenz und Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), hieß ursprünglich vor Jahrzehnten9,10. Mehr induziert direkt, exogene Behandlung mit subletale Dosis von H2O2 Seneszenz11,12. Die Hemmung der ROS-Aufräumvorgang Enzyme wie SOD1, verursacht auch vorzeitige Seneszenz13. Im Gegensatz dazu niedrig ambient sauerstoffbedingungen und Erhöhung der ROS Aufräumvorgang verzögert das Auftreten von Seneszenz10,14,15. Diese Ergebnisse zeigen zweifellos, dass ROS wichtige Mediatoren oder Determinanten der zellulären Seneszenz Induktion sind. Jedoch wie ROS beitragen zur Induktion der zellulären Seneszenz und wie erhöhte ROS Niveaus während der zellulären Seneszenz sind weitere machen Sie Untersuchungen nötig.
Neuere Studien haben gezeigt, dass alternde Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch eine SASP16,17. Im Alter von Gewebe fördern seneszenten Zellen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen über viele Wege durch SASP neben einer autonomen Erschöpfung der proliferativen Zellen. Proinflammatorischen Faktoren, wie IL-6, IL-8, TGFβ und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sezerniert seneszenten Zellen verursachen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen durch Beeinträchtigung der Gewebe Homöostase, Zerstörung der Gewebearchitektur Seneszenz der benachbarten Zellen und sterile Entzündung18,19. Allerdings kann die SASPs je nach biologischen Kontext günstig auswirken. Heterogenetic Artder SASPs hängt darüber hinaus die alternde Zelltyp und Zell-Stadium, betonend, dass weitere Forschung19.
Hier beschreiben wir rasche und sensible zytometrie-basierte Techniken für die Beurteilung der intrazelluläre ROS Ebenen während OIS. Darüber hinaus werden Methoden zur Analyse der SASP Faktoren mit quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) und ELISA eingeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir Methoden für die Überwachung der intrazellulärer ROS Ebenen während H-Ras-induzierte Seneszenz in normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 vorgestellt. Intrazellulären ROS in lebenden Zellen gemessen werden quantitativ mit der Zelle durchlässig Reagenz DCF-DA und flow Cytometry. Auf zelluläre Aufnahme ist DCF-DA deacetylated von intrazellulären Esterasen und anschließend oxidiert durch ROS stark fluoreszierende 2′, 7′-dichlorofluoresceins (DCF) bilden. DCF-Fluoreszenz kann durch Durchflusszytometr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (2015R1D1A1A01060839) (zu jung Yeon Kim) und durch einen National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss von der Regierung von Korea (MSIT) finanziert (Nein 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (um Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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