Summary

Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Published: June 06, 2018
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Summary

Este protocolo describe cómo preparar larvas de Drosophila para análisis metabolómicos basadas en GC-MS.

Abstract

Los avances recientes en el campo de la metabolómica han establecido la mosca de la fruta Drosophila melanogaster como modelo genético poderoso para el estudio de metabolismo de los animales. Combinando la amplia gama de herramientas genéticas Drosophila con la capacidad para examinar grandes áreas del metabolismo intermediario, una aproximación metabolómica puede revelar las interacciones complejas entre dieta, genotipo, eventos de la historia de vida y señales ambientales. Además, estudios de metabolómica pueden descubrir nuevos mecanismos enzimáticos y descubrir conexiones previamente desconocidas entre vías metabólicas aparentemente dispares. Para facilitar el uso más generalizado de esta tecnología entre la comunidad de Drosophila , aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe cómo preparar muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)- basado en análisis metabolómicos. Nuestro protocolo incluye descripciones de muestras larvarias, extracción del metabolito, derivatización química y análisis por GC-MS. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a los usuarios medir la abundancia relativa de pequeños metabolitos polares, como aminoácidos, azúcares y ácidos orgánicos participan en la glucólisis y el ciclo TCA.

Introduction

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema ideal para estudiar el mecanismo molecular que regula el metabolismo intermediario. No se conservan más rutas metabólicas entre Drosophila y los seres humanos sólo sensores de nutrientes claves y reguladores del crecimiento, tales como insulina, Tor y myc, que también son activos en la mosca1,2. Como resultado, Drosophila puede utilizarse para explorar la base metabólica de enfermedades humanas que van desde la diabetes y la obesidad a cáncer y la neurodegeneración. En este sentido, el desarrollo larvario de Drosophila proporciona el marco ideal estudiar un programa metabólico conocido como glucólisis aeróbica, o el efecto de Warburg. Como muchos tumores utilizan glucólisis aeróbica para generar biomasa de hidratos de carbono, así que para hacer Drosophila larvas activan glucólisis aeróbica para promover el crecimiento del desarrollo3,4,5. Estas similitudes entre larvas y tumor metabolismo establecer Drosophila como un modelo clave para entender cómo aeróbico glucólisis es regulada en vivo.

A pesar de que la mosca se ha convertido en un modelo popular para el estudio de metabolismo, mayoría de Drosophila los estudios dependen de los métodos que están diseñados para medir los metabolitos3, como la trehalosa, triglicéridos o ATP. Puesto que se requiere un protocolo específico para medir cada metabolito, estudios basados en análisis son mano de obra intensiva, caros y sesgada hacia los compuestos que se pueden medir utilizando kits comerciales. Una solución a estas limitaciones ha surgido desde el campo de la metabolómica, que proporciona un medio más eficaz e imparcial estudio de metabolismo de Drosophila . A diferencia de un estudio basado en el análisis, un análisis metabolómicos solo puede medir cientos de metabolitos de molécula pequeña y simultáneamente proporcionar una comprensión global de estado metabólico6,7 de un organismo. Esta técnica ha ampliado considerablemente el alcance de los estudios metabólicos de Drosophila y representa el futuro de este emergente campo8.

Estudios metabolómicos se realizan principalmente utilizando tres tecnologías: (i) resonancia magnética nuclear (RMN), (ii) líquida cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS) y (iii) cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)9. Cada enfoque ofrece ventajas y desventajas, y todas estas tecnologías se han utilizado para estudiar con éxito metabolismo de Drosophila . Puesto que las investigaciones realizadas en nuestro laboratorio se centra en metabolitos polares, pequeñas, principalmente empleamos un método GC-MS-basado. GC-MS proporciona al usuario con un número de ventajas, como alta reproducibilidad, máxima resolución, sensibilidad, y la disponibilidad de una biblioteca de espectros de impacto (EI) de electrón estándar, permite la identificación rápida de descubrieron el metabólico características10,11. La preparación de muestras para GC-MS, sin embargo, es algo compleja y requiere una atención cuidadosa al detalle. Muestras y deben realizarse, lavadas, pesadas, congeladas en una manera que sacia rápidamente reacciones metabólicas. Además, el cadáver de mosca es resistente a los protocolos estándar de la homogeneización y requiere un molino de grano para extracción del metabolito óptima. Por último, las muestras analizadas por GC-MS deben someterse a derivatización química antes de detección12. Mientras que métodos previamente publicados describen todos estos pasos3,13,14, todavía es necesario un protocolo visual que permita al usuario principiante reproducible generar datos de alta calidad. Aquí demostramos cómo preparar muestras de larvas de Drosophila para análisis metabolómica basada en GC-MS. Este protocolo permite al usuario medir reproducible muchos de los pequeños metabolitos polares que componen el metabolismo central de carbono.

Protocol

1. huevo de colección Recoger los machos adultos y hembras vírgenes de los genotipos deseados. Individualmente la edad estos animales en un frasco de comida con medios estándar de Bloomington durante 3 – 5 días. Configurar los apareamientos adecuados mediante la transferencia de 25 machos y 50 hembras vírgenes a un nuevo frasco de alimento.Nota: Un mínimo de seis acoplamientos independientes se debe establecer para cada genotipo. Se recogerán sólo una muestra de cada apareamiento (es dec…

Representative Results

Lactato deshidrogenasa (dLDH) mutantes, que carecen de dLDH actividad4y controles emparejados genéticamente fueron recogidos como larvas de mediados-L2 y procesadas según protocolo descrito anteriormente. Comparación con controles, larvas mutantes exhiben cambios significativos en el lactato, piruvato y L-2-hydroxyglutarate4. Los espectros fueron adquiridos con un sistema Agilent GC6890-5973i MS. Un ejemplo de los espectros de GC…

Discussion

Metabolómica proporciona una oportunidad sin precedentes para estudiar las reacciones metabólicas que componen el metabolismo intermediario. La sensibilidad de esta tecnología, sin embargo, procesa datos susceptibles a fondo genético, claves del desarrollo y una variedad de tensiones ambientales, como temperatura, humedad, densidad de población y la disponibilidad de nutrientes. Por lo tanto, una alta calidad y reproducible metabolómica análisis requiere que las muestras se recogerán bajo condiciones altamente co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gracias a los miembros de la Indiana Universidad masa espectroscopia y la Universidad de Utah metabolómica base para ayuda en la optimización de este protocolo. J.M.T. es apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM119557.

Materials

Unsulfured blackstrap molasses Good Food, INC
Drosophila Agar Type II Genesee Scientific 66-103
Pyridine EMD Millipore PX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX) MP Biomedicals, LLC 155405
MSTFA with 1% trimethylchlorosilane Sigma 69478
Fleischmann’s Active dry yeast AB Mauri Food Inc 2192
6oz Drosophila stock bottle Genesee Scientific 32-130
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)  Omni International SKU:19-627
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet Agilent 5181-8872
Succinic acid-2,2,3,3-d4 Sigma 293075
SpeedVac Thermo  SC210A
o-Phosphoric acid Fisher Scientific A242-1
Propionic acid Sigma P5561
p-Hydroxy benzoic acid methyl ester Genesee Scientific 20-258
Bead Ruptor Omni International SKU:19-040E
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000012
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block Benchmark Scientific H5000
Methanol Sigma 34860
1.5 mL centrifuge tube Eppendorf 22364111
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish Corning Incorporated 353001
GC column Phenomex ZB-5MSi

References

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Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics. J. Vis. Exp. (136), e57847, doi:10.3791/57847 (2018).

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